Векторы, используемые в генетической инженерии животных (на основе литических вирусов,

      Комментарии к записи Векторы, используемые в генетической инженерии животных (на основе литических вирусов, отключены

Ретровирусов)

Рассмотрим прямые методы трансформации клеток животных. Наиболее распространенным способом введения ДНК в культивируемые клетки млекопитающих является ее адсорбция на кристаллах фосфата кальция, эти частицы затем поглощаются клетками путем пиноци-тоза. Кальций-фосфатный преципитат ДНК добавляют к клеткам, прикрепленным к субстрату либо открепленным с помощью трипсина или ЭДТА. Для получения достаточно высокой эффективности трансформации (103 — 104 трансформантов на 1 мкг специфической ДНК, например, гена tr) необходима оптимальная концентрация ДНК — около 30 мкг/мл, и поэтому к специфической ДНК, содержащей ген, по которому будет производиться селекция, добавляют неспецифический ДНК-носитель, например, ДНК тимуса теленка или спермы лосося.

При кальциевой процедуре 15 — 90 % клеток акцептируют ДНК. Однако, по-видимому, какая-то ее часть связывается с клеточной мембраной и не попадает в клетку. Через несколько суток после введения небольшая доля клеток уже способна экспрессировать чужеродные гены, однако затем уровень экспрессии падает, и относительно стабильную трансформацию (когда клеток, выживающих при данном селективном давлении, становится больше, чем гибнущих) претерпевает лишь 103 — 105 клеток.

Традиционным способом введения ДНК в клетки, отработанным на вирусных геномах, является метод с использованием ДЭАЭ-декст-рана. При этом повышается эффективность вхождения этой кислоты и ее временной экспрессии, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании кальцийфосфатного метода.

Многие авторы используют слияние с помощью полиэтиленгли-коля культивируемых клеток с протопластами бактерий, содержащими плазмиду с эукариотным геном, или с частицами рекомбинаитного бактериофага, однако в первом случае в клетку попадает не только нужный ген в составе плазмиды, но и вся хромосомная ДНК, которая может повлиять на интеграцию и экспрессию.

Весьма перспективным в настоящее время представляется использование в опытах по генетической трансформации трансдуцирующих ретровирусных векторов, которые позволяют повысить ее эффективность на несколько порядков за счет специфического (рецепторного) механизма проникновения ретровирусных частиц в клетку. Кроме того, фенотип трансформантных клонов оказывается более стабильным, чем обычно, благодаря интеграции за счет ретровирусных конце-вых повторов. Разработка таких векторов рассматривается в настоя-щее время как важный шаг в направлении совершенствования методов генотерапии.

Весьма эффективной, дающей высокую частоту трансформации, является методика введения ДНК путем микроинъекций в культивируемые соматические или зародышевые клетки. Значительная стимуляция ее поступления (непосредственно из внеклеточной среды, без кальция или другого «облегчающего» агента) достигается при микроуколе или электрическом пробое мембраны, но эти методы пока не получили широкого распространения.

В настоящее время в руках исследователей имеется достаточно большой набор клонированных эукариотных промоторов, позволяющих добиваться эффективной экспрессии практически любого гена в разных типах клеток; разработаны методы быстрой проверки различных конструкций типа промотор — структурный ген — терминатор. Установлено, что для внедрения чужеродной ДНК в хромосомы клеток млекопитающих не требуется каких-либо специфических последовательностей этой кислоты, и интегративная рекомбинация может происходить без наличия гомологии. Это позволяет интегрировать в хромосомы путем конвекции произвольные неселектируемые гены, даже если они физически не связаны с селектируемыми. Описано также несколько примеров гомологичной застройки экзогенной ДНК, но еще требуется значительная экспериментальная работа, прежде чем удастся существенно повысить специфичность интеграции и разработать сайт-специфические интегративные векторы. Перспективно в этом плане использование мобильных генетических элементов, как это было сделано в опытах с дрозофилой.

Разрабатываются подходы к конструированию автономных плаз-мидных векторов, однако эта работа тормозится недостатком фундаментальных знаний о контроле хромосомной и виехромосомной репликации ДНК в клетках млекопитающих. Такие знания позволили бы, в частности, контролировать и увеличивать копийиость автономных плазмид и повышать тем самым выходы продуктов локализованных на них генов.

Значительный прогресс достигнут в разработке систем экспрессии чужеродных генов в животных, выращенных из зародышей, в которые была введена ДНК путем микроинъекций. Доказано, что фенотип животных способен изменяться за счет инъецированных генов и экспрессия может быть достигнута даже в тканях, в которых соответствующие собственные гены не работают. Показано, что введенные последовательности могут сохраняться у нескольких поколений мышей, у которых чужеродная ДНК была интегрирована в клетки зародышевого пути, но уровень экспрессии при этом может и не наследоваться. Управление стабильностью наследования и экспрессии вводимых генов требует более глубокого изучения природы процессов митотической и мейотической рекомбинации в клетках млекопитающих.

Выше затрагивался вопрос об использовании вирусов в качестве векторов для интродуцируемых генов. До самого последнего време-

ни эти векторы создавались на основе опкогеиных вирусов, что ограничивало их применение только культурами клеток и делало малопригодными для опытов над целым животным, не говоря уже об использовании в медицине. Более перспективными с этой точки зрения могут быть системы, созданные на основе вируса осповакцииы и папилломы. Так, на примере гена гормона роста человека hGH с вирусом папилломы быка в качестве вектора показана экспрессия данного гена в клетках мыши. Синтез соматотропина под контролем металло-тионового промотора составил в этих клетках (2 -s- 6) • 108 молекул в сутки, т. е. был в 10 раз выше, чем у клеток, в которые вводили геи hGH вектором SV40.

Дополнительные материалы:

Вектор (молекулярная биология)


Похожие статьи: