Репликация. особенности репликации хромосом эукариот

      Комментарии к записи Репликация. особенности репликации хромосом эукариот отключены

ПОЛУКОНСЕРВАТИВНАЯ РЕПЛИКАЦИЯ ДНК И ХРОМОСОМ

Структура ДНК и правило комплементарного спаривания оснований дают представление о возможных механизмах удвоения (репликации) ДНК. Теоретически таких механизмов три.

Цепи отделяются друг от друга, и каждая служит матрицей для построения комплементарной цепи. В результате синтезируются две молекулы, у каждой из которых одна цепь старая и одна новая. Такой способ репликации ДНК называют полу консервативным (рис. 9.1, а).

Если после удвоения одна молекула оказывается состоящей из двух старых цепей, а другая — из двух новых, говорят о консервативном механизме репликации (рис. 9,1,6).

При дисперсном механизме репликации каждая из двух вновь образованных молекул должна содержать в обеих цепях как новые, так и старые участки (рис. 9.1, в). Чтобы узнать, какой из механизмов реализуется в клетках, надо уметь различать старые и новые цепи ДНК. Эту проблему смогли разрешить американские исследователи М. Мезельсон и Ф. Сталь в экспериментах по репликации ДНК кишечной палочки. Бактерии в течение большого числа поколений выращивали на среде, содержащей тяжелый изотоп азота 15N. У таких бактерий весь азот в ДНК замещался этим изотопом, и, следовательно, ДНК имела большую плотность, чем ДНК бактерий, выращенных на нормальной среде. Плотность молекул ДНК можно определить, центрифугируя ее в растворе хлористого цезия с очень высокой скоростью в течение нескольких дней. Под действием силы тяжести молекулы движутся и занимают в пробирке место, в котором их плотность равна плотности раствора. После переноса бактерий на среду с нормальным (легким) изотопом l4N через определенные промежутки времени отбирали образцы культуры, выделяли ДНК и определяли ее плотность. В этих клетках синтезируется новая ДНК, в которую включаются легкие атомы азота. Если новая двойная спираль содержит одну родительскую и одну дочернюю цепи, то спустя одно поколение после переноса будет обнаружена ДН К с промежуточной плотностью; после двух циклов — ДНК с промежуточной плотностью и легкая ДНК. Если репликация консервативна, то старая молекула будет иметь две тяжелые цепи, а новая — две легкие, и после одного, и после двух циклов репликации в нормальной среде будет обнаруживаться как тяжелая, так и легкая ДНК. При дисперсном типе репликации должна появляться ДНК с промежуточной плотностью, но обе цепи молекулы должны содержать и тяжелый, и легкий изотопы. Результаты, полученные М. Мезельсоном и Ф. Сталем, представлены на рис. 9.2. После одного цикла в нормальной среде обнаружена только ДНК с промежуточной плотностью, после двух — половина ДНК имела промежуточную плотность, половина была легкой. При разделении цепей ДНК промежуточной плотности и центрифугировании одноцепочечной ДНК обнаруживаются тяжелые и легкие цепи. Эти результаты свидетельствуют о полуконсервативном типе репликации ДНК у кишечной палочки. Позднее подобные эксперименты проводили с другими прокариотическими и эукариотическими организмами, и всегда оказывалось, что репликация ДНК полуконсервативна.

Удвоение хромосом в ядрах эукариот также происходит полуконсервативным способом. Это было доказано Дж. Тейлором в опытах на митотических клетках корешка бобов Viciafaba. Семена проращивали на среде, содержащей меченый 3Н-ти- мидин. Радиоактивная метка включается в ДНК; ее можно обнаружить в хромосомах

делящихся клеток. Если перенести корешки в среду без метки, во вновь синтезированные цепи ДНК будет включаться немеченый тимидин. После одного деления клеток в нормальной среде метку обнаруживали в обеих хроматидах метафазных хромосом, после второго деления — одна хроматида содержала метку, другая не содержала метки (рис. 9.3). Эти результаты согласуются с представлением о том, что хроматида состоит из одной молекулы ДНК, и ДНК реплицируется полуконсервативно (рис. 9.4). Позднее Дж. Тэйлор показал, что перед мейотическим делением происходит также полуконсервативная репликация ДНК.

Таким образом, репликация ДН К у про- и эукариотических организмов происходит по полуконсервативному механизму. Каждая из двух цепей молекулы служит матрицей для создания комплементарной цепи, и каждая новая молекула состоит из одной родительской и одной дочерней цепи.

ТИПЫ РЕПЛИКАЦИИ ГЕНОМОВ

Репликация начинается с того, что в определенной точке происходит разъединение двойной спирали и образование одноцепочечных участков ДНК, которые служат матрицей для синтеза новой цепи. Участок, в котором в данный момент времени происходит синтез ДНК, называют вилкой репликации. Описано три типа репликации геномов.

Репликация бактериальных и вирусных кольцевых геномов начинается с определенной точки и идет в противоположных направлениях, т.е. у бактерий и вирусов существует одна точка начала репликации (оп) и две репликационные вилки. Реплицирующаяся хромосома напоминает по структуре греческую букву 0. По завершении репликации 0-типа образуются две кольцевые молекулы (рис. 9.5).

У некоторых вирусов (например, у бактериофага X) и при амплификации ДНК генов рРНК в оогенезе у амфибий в одной цепи их кольцевой хромосомы происходит разрыв фосфодиэфирной связи. Затем к свободному З’-концу разорванной цепи начинают присоединяться нуклеотиды, эта цепь растет, а кольцевая цепь служит матрицей. По мере роста разорванной цепи ее 5′-конец постепенно смещается, и начинается построение цепочки, комплементарной этому участку. Образующаяся структура похожа на греческую букву а (сигма). Такой тип репликации называют «катящимся кольцом» или о-ти- пом. Вновь синтезированный «хвост» в определенных точках разрезается, и по завершении одного цикла репликации образуется одна кольцевая молекула и одна линейная. Длина образующегося «хвоста» иногда может в несколько раз превышать длину окружности кольцевой молекулы

Линейные хромосомы (у некоторых вирусов и эукариот) начинают реплицироваться в одной или нескольких

точках, две вилки репликации движутся в противоположных направлениях. По завершении репликации образуются две линейные молекулы (рис. 9.7).

Участок генома в пределах которого репликация начинается и заканчивается, называется репликоном. Геномы прокариот удваиваются целиком, водном цикле репликации, следовательно, их геномы представляют собой один репликон. В геномах эукариот точек начала репликации множество (несколько сотен или тысяч). Репликация ДНК начинается одновременно во многих точках, следовательно, геном представлен множеством репликонов.

Как в любом матричном процессе, в репликации можно выделить три этапа: инициацию, элонгацию и терминацию.

ИНИЦИАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ

Инициация репликации включает формирование репликационной вилки и синтез РНК-праймера. В этом процессе участвует большое число белков и ферментов. Инициирующие белки должны выполнить, по крайней мере, три основные функции: 1) облегчить раскручивание молекул Д Н К и ее локальную денатурацию в области начала репликации; 2) обеспечить связь белков и ферментов, участвующих в репликации, с точками начала репликации; 3) обеспечить координацию клеточного цикла и процессов репликации. Для инициации репликации у эукариот, в отличие от прокариот, связывания инициирующих белков с точками начала репликации недостаточно. Достижение компетентности в данном случае — сложный многоэтапный процесс.

Инициация репликации происходит в строго определенных участках. Выделены и определены последовательности нуклеотидов в точках начала репликации у кишечной палочки Е. coli, многих фагов и плазмид, у дрожжей, млекопитающих и некоторых вирусов эукариот.

У Е. coli этот сайт (oriQ представляет собой участок ДН К размером 245 нуклеотидов, состоящий из серии 9- и 13- нуклеотидных повторов. Область oriC у бактерий очень консервативна, хотя есть виды, у которых она не обнаружена. Процесс инициации начинается с присоединения к хромосоме белка DnaA. Это приводит к разделению цепей и способствует работе основного расплетающего белка — геликазы (DnaB). В решении топологических проблем, связанных с разделением цепей двойной спирали, участвует и фермент гираза. С образовавшейся одноцепочечной ДНК связываются белки SSB (от англ. single strand binding), которые стабилизируют вилку репликации. Фермент праймаза синтезирует РНК-праймеры на лидирующей и отстающей цепях.

Размер и структура элементов, обеспечивающих начало репликации у эукариот и прокариот, различны. Общим для всех сайтов начала репликации является их обога- щенность АТ-парами. По-видимому, это необходимо для обеспечения локальной денатурации, поскольку АТ-пары образуют только две водородные связи.

События, происходящие при инициации репликации у эукариот и связи ее с клеточным циклом, лучше всего изучены у дрожжей. Рассмотрим инициацию репликации и клеточный цикл у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (рис. 9.8). На стадии G1, когда активность циклин-зависимой киназы Cdkl низка, формируется пре-реплика- ционный комплекс, в состав которого входят шесть белков комплекса ORC (ORC1-

и белки Cdc6 и Mem. Высоко консервативные белки, составляющие комплекс ORC специфически связываются сточками начала репликации и служат основой для присоединения других инициирующих белков Cdc6 и Mem. При переходе от стадии G1 к стадии S активность Cdkl возрастает и Cdc6p покидает комплекс. На его место «встает белок Cdc45. В этой перестройке комплекса, необходимой для активации точки начала репликации в течение стадии S, принимает участие белок Cdc7-Dbf4- киназа. После инициации репликации пре-репликационный комплекс превращается в пост-репликационный, он состоит только из белков ORC, связанных с хроматином. Этот комплекс сохраняется до конца митоза, когда активность Cdk 1 падает. Образование нового пре-репликационного комплекса становится возможным только в следующей стадии G1. Таким образом, в течение одного клеточного цикла происходит лишь один цикл репликации. Белки ORC остаются связанными с точкой начала репликации, другие компоненты пре-репликационного комплекса или покидают его, или становятся частью вилки репликации. Например, белки Mcm2p-Mcm7p, по-видимому, функционируют как репликативная геликаза. У всех изученных эукариот схема событий и белки, участвующие в инициации, сходны. Однако есть и некоторые отличия. Так, у некоторых организмов (другой вид дрожжей, дрозофила, ксенопус) для присоединения Mcm2p-Mcm7p к хроматину необходим дополнительный белок Git 1. У дрожжей белки ORC остаются связанными с хроматином на всех стадиях клеточного цикла, а у позвоночных во время митоза они отделяются от хроматина и вновь соединяются с ним только в стации G1. До сих пор не ясно, как репликационная машина (а-ДНК-полимераза-праймаза и репликационный белок А) связывается с точкой начала репликации, как части инициирующего комплекса (Mcm2p-Mcm7p и Cdc45p) преобразуются в компоненты вилки репликации. Гены, кодирующие основные белки, участвующие в инициации репликации ДН К у человека, приведены в табл. 9.2.

Разделение двойной спирали происходит с помощью ДНК-геликазы и реплика- ционного белка RPA (от англ. — replication protein Л). Репликационный белок А, состоящий из трех полипептидов, связывается с одноцепочечный ДНК, таким образом он выполняет ту же функцию, что и SSB-белки у кишечной палочки. Затем а- ДНК-полимераза-праймаза синтезирует короткие (длиной примерно 30 п.н.) РНК- праймеры на лидирующей и отстающей цепях. После этого происходит замена а- полимеразного комплекса на комплекс 5-ДНК-полимеразы — основного фермента репликации ДНК у эукариот.

ЭЛОНГАЦИЯ ЦЕПЕЙ ДНК

Синтез новых цепей ДНК осуществляется группой ферментов с общим названием ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы многих организмов выделены и хорошо охарактеризованы. Все полимеразы способны образовывать ковалентную связь между З’-концом цепи и 5′-концом свободного нуклеотидтрифосфата. Следовательно, новая цепь растет в направлении от 5′-конца к З’-концу вдоль матричной цепи, имеющей противоположное направление 3′ -» 5′ (рис. 9.9). Реакцию присоединения нуклеотида эти ферменты осуществляют только в присутствии одноцепочечной матрицы и короткого двухцепочечного участка со свободным З’- концом — праймера. Первый дезоксирибонуклеотид присоединяется к З’-концу РНК-праймера. Затем ДНК-полимераза один за другим присоединяет нуклеотиды, строя, таким образом, цепочку ДНК. Поскольку все полимеразы способны строить цепь только в одном направлении, на 3’—5′ родительской цепи синтез новой цепи будет идти непрерывно, эту цепь принято называть лидирующей. Лидирующая цепь растет в направлении движения вилки, для ее элонгации необходим лишь один акт инициации. На другой цепи синтез осуществляется короткими фрагментами, которые называют фрагментами Оказаки по имени исследователя, впервые их обнаружившего (рис. 9.9). Эта цепь называется запаздывающей, или отстающей. Длина фрагментов Оказаки составляет 1 000-2 ООО п.н. у прокариот и 100—200 п.н. у эукариот. Отстающая цепь растет в направлении противоположном движению вилки, при ее синтезе необходимо множество актов инициации.

Фрагменты Оказаки объединяются в непрерывную цепь ДНК после удаления РНК-праймеров и застраивания освободившихся участков дезоксирибонуклеотида-ми. Реакцию сшивания фрагментов осуществляют ферменты ДНК-лигазы, которые катализируют образование ковалентной связи между З’-ОН одного фрагмента и 5′-фосфатом следующего.

Общая схема процессов, происходящих при элонгации цепей, одинакова у про- и эукариот.

У кишечной палочки в репликации ДНК участвуют два фермента: ДНК-поли- мераза I и ДНК-полимераза III. Ключевым ферментом репликации является ДНК-полимераза III. Полный комплекс ДНК-полимеразы III, способный осуществлять реакцию полимеризации, включает, по крайней мере, 20 разных белков, но каталитическую функцию выполняют 3 субъединицы — а (альфа), обладающая полимеразной активностью, е (эпсилон), обладающая 3′ — 5’экзонуклеазной активностью, и 0 (тета), функция которой пока неясна. Функции других субъединиц тоже неизвестны. Одна из них — (3 — уменьшает вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования. В каждой вилке репликации находится две молекулы холофермента, а в клетке -10-20 молекул. Он синтезирует ДН К лидирующей и отстающей цепей.

Д Н К-полимераза I участвует в синтезе отстающей цепи. Этот фермент состоит из одной полипептидной цепи и имеет 3 ферментативные активности. Благодаря 5′ — З’-экзонуклеазной активности он удаляет РНК-праймер, отщепляя рибонуклеотиды с 5′-концов фрагментов Оказаки. Его полимеразная активность обеспечивает наращивание цепи ДНК предыдущего фрагмента. 3′ — 5′-экзонуклеазная активность позволяет контролировать правильность присоединения каждого нуклеотида и удалять ошибочно вставленные неспаренные нуклеотиды с растущего конца цепи.

В репликативном синтезе ядерной ДНК эукариот участвуют два фермента: б- и е- ДНК-полимеразы. Наращивание лидирующей и отстающей цепей обеспечивает сложный белковый комплекс, в составе которого самое важное значение имеет 5-ДН К-полимераза, репликационный фактор RFC (от англ. replication factor Q и белок PCN А (от англ. proliferating celt nuclear antigen). Репликационный фактор RFC состоит из пяти субъединиц различной молекулярной массы (140/145,40, 38, 37 и 36.5 кДа). Этот белок связывается с З’-концом только что синтезированного праймера и блокирует его наращивание, выполняемое а-ДНК-полимеразой) при длине примерно 30 нуклеотидов. На этой стадии RFC способствует связыванию ДНК с белком PCNA, который, по-видимому, играет роль связующего звена между полимеразами идругими белковыми факторами комплекса. В результате этих процессов а-ДНК-по- лимераза вытесняется с З’-конца растущей цепи. Дальнейший синтез продолжается другими ферментами — 5- и в-полимеразами. 5-ДНК-полимераза человека — муль- тимерный белок, состоящий из четырех субъединиц 125, 50, 68 и 12 кДа. Тройной комплекс RFC-PCNA-5-ДНК-полимсраза обеспечивает элонгацию обеих цепей ДНК (рис. 9.10). Кроме репликации 5-ДНК полимераза участвует и в репаративных синтезах ДНК.

Удаление праймеров и сшивание фрагментов Оказаки происходит с участием 5- ДНК-полимеразы, РНКазы Н, ДНК-лигазы и флэп-эндонуклеазы. РНКаза Н катализирует расщепление РНК в гибридных РНК-ДНК-молекулах, флэп-эндонуклеа- за отщепляет так называемые «свисающие 5′- концы», которые образуются в результате того, что 5-ДНК-полимераза обеспечивает синтез с вытеснением цепи.

Синтез митохондриальной ДНК осуществляету-ДНК-полимераза. Но механизм репликации ДНК в митохондриях несколько отличается от репликации хромосомной ДНК прокариот и эукариот. Наиболее важная особенность репликации митохондриальной ДНК — наличие сайтов инициации, специфичных для каждой из комплементарных цепей ДНК. Ген POLG, кодирующий у-ДНК-полимеразу у человека, локализован в 15q25. Праймер синтезируется митохондриальной ДНК-зависи- мой РНК-полимеразой, отвечающей как за экспрессию митохондриальных генов, так и за создание РНК-праймера для инициации репликации митохондриального генома. У человека этот белок кодирует ген POLRMT, локализованный в 19р13.3. Продукт этого гена больше похож на РНК-полимеразы фагов и митохондриальные полимеразы низших эукариот.

Другие многочисленные ДН К-полимеразы эукариот обеспечивают синтез ДН К, необходимый для репарации повреждений ДН К и рекомбинации.

ТЕРМИНАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ

У кишечной палочки существует участок, который обеспечивает терминацию репликации ДНК. В этом участке содержится несколько коротких последовательностей, гак называемых fer-сайтов (длиной =23 п.п.). Прекращение движения репликацион- ной вилки обеспечивается связыванием продукта лена tus с сайтами терминации.

Точки терминации — не обязательный элемент репликона. При двунаправленной репликации синтез ДНК прекращается, когда встречаются репликационные вилки. У эукариот синтез прекращается, когда встречаются вилки соседних репликонов.

СКОРОСТЬ РЕПЛИКАЦИИ

Скорость роста новой цепи практически постоянна. У Е. coli скорость копирования составляет примерно 1 500 нуклеотидов в секунду. Скорость движения репликацион- ной вилки в эукариотических клетках много ниже — 10—100 п.н. в секунду.

Скорость репликации генома определяется в основном частотой инициации репликации. Высокая скорость репликации генома у эукариот обеспечивается одновременной инициацией множества точек начала репликации. Например, в клетках ранних эмбрионов дрозофилы репликация всего генома происходит каждые 3 мин, точки начала репликации отстоят друг от друга на 7 000-8 000 п.н. В культуре клеток дрозофилы скорость репликации генома значительно ниже, инициируется меньше точек начала репликации, они располагаются на расстоянии 40 000 п.н. друг от друга.

ТОЧНОСТЬ РЕПЛИКАЦИИ

Точность копирования ДНК чрезвычайно высока. Ошибочное включение основания происходит с частотой Ю~8-Ю-10. Однако известно, что физико-химиче- ские свойства оснований при образовании водородных связей должны давать более высокую частоту ошибок — до 10-2. Высокая точность копирования достигается благодаря контрольным и корректорским функциям ДНК-полимераз, участвующих в репликативном синтезе ДНК.

РЕПЛИКАЦИЯ ТЕЛОМЕР

При репликации линейных молекул ДНК возникает проблема репликации концов. Поскольку все Д Н К-полимеразы осуществляют синтез только с использованием РНК-праймеров, и праймеры впоследствии удаляются, то 5′-конец цепи должен укорачиваться на длину праймера, т.е. на 10-30 нуклеотидов. Последовательное исчезновение концевых участков неизбежно должно приводить к потере генов. Теломеры — концевые участки хромосом, которые не несут генетической информации, а служат для защиты материала хромосомы от потерь при репликации и от атак эндонуклеаз. Е. Блакберн и Дж. Голл выделили теломерную ДНК и расшифровали ее структуру. Теломеры у всех изученных организмов имеют сходное строение: они состоят из многократно повторяющихся фрагментов, например у человека это — TTAGGG. Во время деления нормальной соматической клетки теломеры теряют от 5 до двадцати фрагментов и с каждым делением становятся короче. Укорочение до определенной критической длины становится сигналом к прекращению делений. Показано, что у соматических клеток есть лимит на число клеточных делений. При культивировании клеток, взятых у новорожденных детей, они могут пройти 80-90 делений, клетки 70-летних делятся только 20—30 раз. Ограничение на число клеточных делений называют порогом Хейфлика. Обычно клетки не преодолевают барьер из 20-90 делений. В раковых клетках ижклетках зародышевого пути, где число делений не ограничено, обнаружен фертК! гг теломераза, который перед каждым циклом репликации добавляет TTAGGG-повторы к теломерам и таким образом компенсирует укорочение, вызванное работой ДНК-полимеразы. Теломераза присоединяет повтор последовательно нуклеотид за нуклеотидом к З’-концу, при этом родительская Д Н К не используется в качестве матрицы. Теломераза — это рибонуклеопротеиновый комплекс, РНК которого содержит последовательность нуклеотидов, выступающую в роли матрицы для синтеза TTAGGG-повтора.

Транскрипция ДНК у эукариот: этапы, ферменты, генетический контроль. Альтернативный сплайсинг.

Транскрипция — передача генетической информации с ДНК на РНК —достаточно подробно описана в различных учебниках биохимии. Остановимся только на основных особенностях этого процесса, осуществляемого с помощью ферментов и белковых факторов.

Ферменты и белковые факторы транскрипции. Ключевой фермент транскрипции — PH К-полимераза. У прокариот она состоит из пяти субъединиц, одна из которых (о-субъединица) предназначена для инициации транскрипции, а другие — для ее элонгации. У эукариот обнаружено три РНК-полимеразы, их локализация в клетке и функции различны. РНК-полимераза 1 выявляется в ядрышке и ответственна за транскрипцию рРНК, РНК-полимераза II находится в нуклеоплазме и обеспечивает 20—40% клеточной активности. Она ответственна за синтез гетерогенной ядерной РНК (гяРНК) — предшественника мРНК. РНК-полимераза III локализована в нуклеоплазме и осуществляет синтез малых ядерных PH К, тРН К и 5S PH К. Однако многие малые РНК транскрибируются РНК-полимеразой II. За раскручивание ДНК на участке, подлежащим транскрибированию, а также спирализацию ДНК после окончания синтеза РНК и отсоединение транскрипта от ДНК отвечают ДНК-топоизоме- разы. В процессе аутосплайсинга задействованы рибозимы РНК с ферментоподобной активностью.

У бактерий РНК-полимераза связывается непосредственное промотором, а у эукариот для этогонеобходимо присутствие дополнительных белков. Белки, которые помогают РНК-псшимеразе узнать промотор, называют факторами транскрипции (TF — от англ. transcription factor). В отличие от о-фактора они могут присоединяться к Д Н К независимо. Например, белок ТВР связывается с ТАТА-боксом промотора, NF-El-эритроид-специ- фический фактор; TF-II-факторы образуют базальный транскрипционный комплекс с РНК-полимеразой II,TF-III — с РНК-полимеразой III.

ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ

Транскрипция, как и другие процессы синтеза биополимеров, состоит из следующих этапов: инициации, элонгации и терминации. Инициация важнейший этап, во время которого осуществляется регуляция процесса транскрипции.

РНК-полимераза прокариот выбирает матричную цепь, находит промоторный участок (структура его описана ниже) и локально расплетает цепи ДНК. После образования гибридного ДНК/РНК-олигонуклеотида одна из субъединиц, называемая сигмой, отделяется от РНК-полимеразы. Следующий этап — элонгация, как и все матричные процессы, проходит в направлении 5′- 3′. Синтезируемая вновь молекула РНК комплементарна матричной цепи. РНК-полимераза осуществляет элонгацию цепи РНК путем присоединения рибонуклеозидмонофосфатов из рибонуклеозид- трифосфатов: ATP, GTP, UTP, СТР.

У бактерий частично синтезированная молекула РНК соединяется с рибосомами, и еще до окончания процесса транскрипции с 5′-конца начинается трансляция. На З’-конце находятся терминаторные последовательности ДНК, ответственные за прекращение транскрипции. У прокариот существует два типа терминации: р-зависимая, требующая участия р-факторов, и p-независимая. После окончания транскрипции, как у прокариот, так и у эукариот происходит цепь биохимических реакций, которая приводит к созреванию молекул предшественников: транспортной РНК (пре-тРНК) и рибосомной РНК (пре-рРНК) и пре-мРНК (только у эукариот). Совокупность реакций, приводящая к формированию зрелой (готовой к трансляции) молекулы мРНК, называется процессингом.

Особенности транскрипции у эукариот. Процессинг мРНК. Процессинг включает следующие преобразования молекулы мРНК: 1) метилирование и кэпирование; 2) полиаденилирование; 3) сплайсинг.

Эукариотические мРНК несут, как правило, на 5′-конце дополнительную группу: КЭП-модифицированный в 7-положении метилированный остаток гуанозин- 5′-трифосфата, соединенный с концевым нуклеозидом 5′-5′-способом. Кэпирование РНК осуществляется ферментами: гуанилтрансферазой и метилтрансферазой. Предполагают, что КЭП необходим для регуляции трансляции и для стабилизации мРНК, (он предохраняет ее от действия 5′-экзонуклеаз). К З’-концу РНК после завершения ее синтеза с помощью фермента поли(А)-полимеразы присоединяется последовательность полиадениловой кислоты. Этот процесс называют полиаденили- рованием. Остальные варианты преобразования пре-мРНК: вырезание интронов и сшивание экзонов (сплайсинг) в эукариотических генах, а также образование различных сочетаний экзонов, входящих в зрелую м PH К (альтернативный сплайсинг) — описаны в гл. 3 и 4.

Эукариотические мРН К в отличие от прокариотических стабильны в течение часов и суток. Это объясняется, во-первых, стабилизацией 5′- и З’-концов, а во-вто- рых, связыванием мРНК с белками (т.е. образованием информосом). Пре-мРНК на всех стадиях процессинга и после него связана с белками. Информосомы могут быть ядерными и цитоплазматическими. Ядерные информосомы — это рибонуклеопро- теиновые (РНП) частицы с константой седиментации 30S. Посттранскрипционный внутриядерный перенос пре-мРНК из ядра в цитоплазму осуществляется с помощью ядерных информосом. При этом переносе зрелой мРНК происходит замена связанных с мРН К белков. Ядерные информоферы (белковые глобулы) остаются в ядре, а мРНК после перехода в цитоплазму объединяется с новыми белками, образуя цитоплазматические информосомы. Цитоплазматические информосомы не обязательно транслируются, т.е. могут быть свободными.

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

Промоторы. Регуляция экспрессии генов эукариот основана на тех же принципах, что и у прокариот, хотя существуют и различия. Во-первых, как уже упоминалось, у эукариот нет оперонов, и каждый ген представляет собой независимую транскрипционную единицу. Промоторы эукариот несколько отличаются от прокариотических по структуре. Функционально наиболее важные последовательности в промоторе эукариотического гена находятся в положениях «-25» (бокс Хогнесса) и «-75». Есть и другие участки, более удаленные от стартовой точки транскрипции.

Другую структуру имеют промоторы генов транспортных, рибосомных РНК и 5SPHK. Прежде всего, эти промоторы внутренние, поэтому перед номерами их нуклеотидов ставится знак «+». Промотор гена тРНК представлен на рис. 12.4. В промоторе гена тРН К имеются А- и В-боксы. Установлены их канонические последовательности. При уменьшении расстояния между боксами транскрипция снижается или полностью прекращается. Замена всего одного нуклеотида в В-боксе в положении 56 CG -» GC в T%G петле искажает правильную структуру тРН К. Регуляторная область гена 5S имеет сходную структуру. Она расположена между +50- и + 90-нуклеотидами и также имеет А- и С-боксы (рис. 12.5).

Энхансеры. Среди регуляторных элементов эукариот выделяют энхансеры, которые обычно располагаются достаточно далеко от регулируемого гена. Предполагается, что сближение энхансера и промотора достигается в результате образования между ними петли ДНК, при этом белки-активаторы, «узнающие» энхансер, могут непосредственно взаимодействовать с транскрипционным комплексом.

Энхансеры — усилители транскрипции — обладают следующими свойствами:

могут находиться как в 5′, так и в З’-областях, а также в интронах и даже на значительном расстоянии от промоторов;

активируют гены независимо от ориентации;

один энхансер может активировать различные гены;

действие их может быть ткане- и видоспецифичным;

энхансеры доступны действию различных белков, в том числе и гормонов

Сайленсеры — ослабители транскрипции — являются негативными элементами по отношению к транскрипции. Они так же, как и энхансеры, функционируют в цис- положении и могут оказывать свое действие на большом расстоянии от гена и при разной ориентации по отношению к нему.

Транскрипционные факторы. Многоклеточные эукариоты состоят из различных типов клеток, разнообразие которых обусловлено дифференциальной экспрессией генов, определяющих образование тканеспецифических белков. Один из механизмов, лежащих в основе дифференциальной экспрессии, — регуляция процесса транскрипции.

Так, изучено влияние регуляторных белков на активность промотора альбуминового гена ALB млекопитающих, функционирующего в клетках печени. Левее стартовой точки расположены: последовательность промотора ТАТА (определяющего начало транскрипции, но не частоту инициации этого процесса) и последовательность ССААТ (влияющая на эффективность транскрипции). Тканевая специфичность определяется взаимодействием специфических факторов транскрипции со вспомогательными последовательностями промотора РЕ, DEI, DEII, и DEIII (рис. 12.6). Последовательность РЕ у мыши (из 13 нуклеотидов) служит сайтом связывания для тканеспецифического белка печени — HNFI. С последовательностью DE1 взаимодействует белок СВР, ас DE11 — NF1. Эти белки не обладают специфичностью, их роль — активация процесса транскрипции. Пока не ясно, каким образом взаимодействуют специфические и неспецифические белки в регуляторной области гена ALB.

Установлены сайты связывания регуляторных белков в промоторе гена (5-интерферона IFN. Промотор этого гена находится между парами оснований —204 и +1. Левее ТАТА-бокса расположены последовательности пяти элементов, две из которых (NRDI и NRD2) ответственны за негативную регуляцию, а три (PRDI, PRD1I и PRD111) способствуют активации транскрипции при присоединении к ним соответствующих белков. Механизм смены этих процессов пока не изучен.

Факторы транскрипции и ядерный матрикс. Ядерный матрикс был открыт в 50-е годы прошлого века И.Б. Збарским. Эта структура состоит из нерастворимых белков. Именно на нем происходит процесс транскрипции и созревания пре-мРНК. Показано, что факторы транскрипции, соединяясь с ядерным матриксом, обеспечивают правильное пространственное расположение промоторных и энхансерных участков генов (рис 12.7). Они взаимодействуют с ДНК в участках связывания с матриксом и другими белками ядерного матрикса, которых выявлено не менее 50. К ним относятся белки, связывающиеся с ДНК посредством «цинковых пальцев» (SP-1, МуТ1, ZNF74, ATRX); белки, связывающиеся с ДНК с помощью «лейциновой застежки- молнии» (С/EBP, ATF, YY-1); рецепторы стероидных гормонов и ассоциированные с ними факторы; белки с HMG-доменом (HMG1, HMG2, HMG14, HMG17, AVL-1B, NMP2) и многие другие.

Часто транскрипционные регуляторные факторы имеют специфическую структуру, например, структуру типа «цинковых пальцев». Она характеризуется аминокислотными петлями, имеющими в основании два цистеина в одной части петли и два гистидина — в другой, связанные ионом цинка (рис. 12.8). Наряду с такими ферментами как PH К-полимеразы и топоизомеразы, в клетках эукариот присутствуют различные регуляторные белки, взаимодействующие с промоторами, энхансерами и сайленсерами. Таким белком является Р1, взаимодействующий с CCGCCC-блоком и ядерный фактор, связывающийся с СААТ-блоком. Нуклеосомы в активном хроматине соединены с белками HMG14 и HMG17.

В научной литературе обсуждаются различные гипотезы, обьясняющие, как РНК-полимераза может транскрибировать хроматин. В соответствии с одной из них, нуклеосома разворачивается, половинки ее сердцевины разъединяются, РНК-полимераза транскрибирует ДН К, а затем половинки нуклеосомы опять складываются. Согласно другой модели, РНК-полимераза транскрибирует витки ДНК, которые нуклеосома сбрасывает по очереди: сначала один виток, а затем — другой.

Метилирование оснований ДНК. Значительную роль в регуляции экспрессии генов у эукариот может играть метилирование ДНК (обычно по 5-му углероду цитозина). Неактивные гены содержат относительно много метальных групп. Состояние повышенного метилирования может стабильно поддерживаться в течение многих поколений клеток. Для этого существует специальный механизм,

обеспечивающий присоединение метальных групп в местах, аналогичных тем, где уже произошло метилирование вдругой цепи. Механизм действия метальных групп заключается втом, »по они нарушают взаимодействия ДНК-белок. Выступая в большую бороздку ДНК, метальные группы препятствуют связыванию транскрипционных факторов. Кроме того, метилированные районы ДН К могут взаимодействовать с транскрипционными репрессорами типа МеСР2, являющегося составной частью белкового регуляторного комплекса.

Импринтинг. Феномен импринтинга демонстрирует роль метилирования в регуляции экспрессии генов. Суть этого феномена заключается в том, что аллели, унаследованные от отца и матери, экспрессируются по-разному. Согласно одной из гипотез, это связано с различным метилированием аллелей при образовании половых клеток. Подробно болезни импринтинга рассмотрены в части II. Медицинская генетика.

Другой пример влияния метилирования на активность генов — лайонизация одной из Х-хромосом у женщин. Гены инактивированной (лайонизированной) хромосомы почти все метилированы.

НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ГЕННОЙ АКТИВНОСТИ

Этот тип регуляции может проявиться на разных уровнях организации генетического материала (генном, хромосомном, геномном).

Примером неспецифической регуляции на генном уровне может служить потеря активности любого гена, попавшего в гетерохроматин, при этом наблюдается так называемый «эффект положения генов». Так, у гетерозиготных самок w+/w проявляется аллель while из-за потери активности нормального аллеля вследствие переноса его в прицентромерный гетерохроматин с помощью инверсии (см. рис. 5.3).

Примером регуляции активности генов на хромосомном уровне является потеря активности генов в половом хроматине, т.е. в гетерохроматизированных половых хромосомах. Факультативная гетерохроматизация достигается в этих хромосомах за счет плотной упаковки хроматина. Вследствие такой конденсации гены, локализованные в этих половых хромосомах, не транскрибируются.

В ходе развития может быть инактивирован и весь геном. У диплоидных самцов мучнистого червеца Planococcus cirti теряют активность все «отцовские» хромосомы, которые также, как и половые хромосомы у млекопитающих, способны к факультативной гетерохроматизации. Самцы этого вида имеют эухроматиновый материнский набор хромосом и гетерохроматиновый гаплоидный набор, полученный от отца, в то время как у самок активны оба набора хромосом, поэтому самцы мучнистого червеца, несмотря на наличие диплоидного набора хромосом, функционально гаплоидны.

Гетерохроматизироваться могут все хромосомы диплоидного организма (например, в эритроцитах у кур).

Альтернативный сплайсинг — процесс, в ходе которого экзоны, вырезаемые из пре-мРНК, объединяются в различных комбинациях, что порождает различные формы зрелой мРНК. В результате один ген может порождать не одну, а множество форм белка. Для некоторых описаны альтернативные пути сплайсинга и полиаденилирования одного и того же транскрипта. Экзон одного варианта сплайсинга может оказаться интроном в альтернативном пути. Поэтому молекулы мРНК, образованные в результате альтернативного сплайсинга, различаются набором экзонов. Это приводит к образованию разных мРНК, и соответственно, разных белков одного первичного транскрипта. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Например, ген тропонина состоит из 18 экзонов и кодирует многочисленные изоформы этого мышечного белка. Разные изоформы тропонина образуются в разных тканях и на определенных стадиях их развития.

Пре-мРНК некоторых генов эукариот могут подвергаться альтернативному сплайсингу. При этом интроны в составе пре-мРНК вырезаются в разных альтернативных комбинациях. Разные варианты альтернативного сплайсинга одной пре-мРНК могут осуществляться в разные периоды развития организма или в разных тканях, а также у разных особей одного вида[1]. Как правило, при альтернативном сплайсинге из первичного транскрипта удаляются и некоторые экзоны.

Существует несколько механизмов альтернативного сплайсинга:

1. Экзон может вырезаться или оставаться в составе мРНК.

2. Один из двух «взаимоисключающих» экзонов вырезается, а другой остаётся.

3. Использование альтернативного донорных сайтов: используются разные 5′-точки разрезания первичного транскрипта (донорные сайты), что изменяет 3′-границу вышележащего (upstream) экзона

4. Использование альтернативных акцепторных сайтов: используются разные 3′-точки разрезания транскрипта (акцепторные сайты), так что меняется 5′-границы нижележащего (downstream) экзона.

5. Сохранение интронов в составе мРНК. В этом случае для сохранения функциональности белка интрон должен содержать последовательность нуклеотидов, не вызывающую сдвиг рамки считывания и не содержащую стоп-кодонов.

Существуют и другие механизмы альтернативного сплайсинга.

Некоторые из продуктов альтернативного сплайсинга пре-мРНК нефункциональны (такой вариант альтернативного сплайсинга осуществляется у дрозофилы при определении пола), но нередко в результате альтернативного сплайсинга пре-мРНК одного гена образуются многочисленные мРНК и их белковые продукты.[2]

Показано, что у человека 94 % генов подвержено альтернативному сплайсингу (у остальных 6 % генов нет интронов). Геном круглого червя Caenorhabditis elegans по количеству генов практически не отличается от генома человека, однако альтернативному сплайсингу подвергаются пре-мРНК только 15 % генов. Таким образом, альтернативный сплайсинг позволяет увеличить разнообразие белковых продуктов генов, сохраняя при этом относительно небольшое количество различных генов в геноме и не создавая избыточных копий генов.

Дополнительные материалы:

Особенности национальной охоты (фильм)


Похожие статьи: