Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра

      Комментарии к записи Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра отключены

Колориметрическим методом определяют концентрацию веществ в окрашенных прозрачных растворах по интенсивности окраски раствора. В основу колориметрического метода анализа положен закон Ламберта-Бугера-Бера: поглощение света прямо пропорционально концентрации вещества в растворе и зависит от толщины слоя (толщины кювет, d). В фотометрии используют монохроматический свет (свет определенной длины волны, l).

Принципиальная схема устройства фотоэлектроколориметра

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра

Расчет концентрации вещества

1) по формуле (с использованием стандартного раствора, с известной концентрацией вещества);

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра

где Со – концентрация опытной пробы;

Ео – экстинкция опытной пробы;

Сст — концентрация стандартной пробы;

Ест — экстинкция пробы со стандартным раствором.

2) по калибровочному графику, который строят, используя стандартные растворы, содержащие различные известные концентрации вещества и сопутствующие им показания оптической плотности.

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 2

РАБОТА № 1. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ

Обоснование выполнения работы. Цветные реакции на белки и аминокислоты позволяют обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, установить аминокислотный состав. Эти реакции применяют как для качественного, так и для количественного определения белков и аминокислот.

1. Биуретовая реакция на белки

Принцип метода. Раствор белка в щелочной среде в присутствии сульфата меди (NaOH/CuSO4) окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена образованием комплексного соединения ионов меди с пептидными группами белка, которых должно быть не менее двух. Таким образом, эта реакция открывает все белки, а также низкомолекулярные пептиды.

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ О П Ы Т
Раствор белкаNaOH, 10 %CuSO4, 1 % 5 капель5 капель2 капли

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

2. Нингидриновая реакция

Принцип метода: аминокислоты, пептиды и белки при кипячении с раствором нингидрина дают синее окрашивание (комплекс Руэмана). Реакция характерна для аминогрупп, находящихся в альфа-положении.

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра СО2

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра АМИНОКИСЛОТА + НИНГИДРИН ® ШИФФОВО ОСНОВАНИЕ

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра АЛЬДЕГИД

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра

АМИНОДИКЕТОГИДРИНДЕН + НИНГИДРИН КОМПЛЕКС РУЭМАНА (СИНЕ-ФИОЛЕТОВОГО ЦВЕТА)

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ О П Ы Т
Раствор белкаНингидрин 0,5 % 5 капель5 капель
Кипятить до появления окраски

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

1. Ксантопротеиновая реакция Мульдера

(на ароматические аминокислоты)

NO2

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра t° 100°C

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра HO? ?CH2?CH?COOH + 2HNO3 HO? CH2?CH?COOH

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра ¦ ¦

NH2 NO2 NH2

тирозин динитротирозин

Принцип метода. Ароматические аминокислоты (фенилаланин, тирозин, триптофан) при нагревании с азотной кислотой нитруются. Это проявляется развитием желтого окрашивания.

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ О П Ы Т
раствор белка HNO3 концентрированная 5 капель5 капель
Кипятить до появления окраски

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

4. Реакция Фоля на цистеин

Принцип метода. Реакция характерна для слабосвязанной серы в составе аминокислоты цистеин. Конечный продукт – сульфид свинца – черного цвета.

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра 2Н2О

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра ЦИСТЕИН + 4NaOH + (СН3СОО)2 Рb СЕРИН + РbS + 4NaOH + +2CH3COOH ацетат свинца сульфид

свинца

Ход работы: взять пробирку.

ОТМЕРИТЬ О П Ы Т
Раствор белкаNaOH, 30 %Раствор (СН3СОО)2 Рb 5 % 5 капель5 капель1 каплю
Кипятить до появления окраски.

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА ПЛАЗМЫ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Принцип метода. БЕЛОК + NaOH/CuSO4 = сине-фиолетовый цвет, интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.

Ход работы: взять две пробирки: контрольную и опытную.

ОТМЕРИТЬ КОНТРОЛЬ О П Ы Т
Реактив ГорналасывороткаNaCl 0,9 % 4,0 мл-0,1 мл 4,0 мл0,1 мл-
Перемешать, фотометрия через 20 минут.Кювета 10 мм, l = 540 нм (зеленый светофильтр)

РЕЗУЛЬТАТ: измерение на колориметре проводят против контрольной пробы и отмечают экстинцию. Eоп =

Конечный результат: определяют по калибровочному графику.

Cоп = г/л

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Нормальное содержание общего белка (общий белок крови = альбумины + глобулины + фибриноген) в сыворотке крови у взрослых — 65-85 г/л, у новорожденных 47-65 г/л, у детей 2-14 лет 62-80 г/л.

Повышение концентрации общего белка сыворотки крови (гиперпротеинемия) характерно для: ревматоидного артрита, коллагенозов, бронхоэктатической болезни, миеломной болезни, гипериммуноглобулинемии, а также гипогидратации организма (рвота, понос) и венозного стаза;

Снижение концентрации белка в сыворотке крови (гипопротеинемия) отмечается при: голодании, беременности, нефротическом синдроме (гломерулонефрит), хронических заболеваниях печени (гепатиты и циррозы), гастроэнтеропатиях, ожогах, раковой кахексии.

ВЫВОД:

Дата: ________________

ЗАНЯТИЕ № 3

РАБОТА № 1. ОСАЖДЕНИЕ БЕЛКОВ КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ МИНЕРАЛЬНЫМИ КИСЛОТАМИ

Обоснование выполнения работы: демонстрируют влияние химических факторов на устойчивость белков в растворах.

Принцип метода: белок осаждается вследствие химической денатурации белка и образования комплексной соли белка с кислотами.

Ход работы: взять опытную пробирку.

ОТМЕРИТЬ ОПЫТ
HNO3концентрированная Раствор белка 10 капель- 10 капель

Наклонив пробирки под углом 45о, осторожно по стенке пробирки приливают раствор белка так, чтобы обе жидкости не смешивались.

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

РАБОТА № 2. РАЗДЕЛЕНИЕ АЛЬБУМИНОВ И ГЛОБУЛИНОВ ЯИЧНОГО БЕЛКА МЕТОДОМ ВЫСАЛИВАНИЯ

Обоснование выполнения работы. Высаливанием обратимо осаждают белки, фракционируют их. Используют для выделения белков, в том числе ферментов.

Принцип метода. При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение заряда. Осаждение белка обратимо и зависит от молекулярной массы белка и дегидратирующей способности растворов нейтральных солей.

Ход работы: взять две пробирки (опыт 1 и опыт 2).

ОТМЕРИТЬ ОПЫТ 1 ОПЫТ 2
Раствор белкаNaCl (порошок) (NH4)2SO4насыщенный раствор (100 %) 1,0 млдо насыщения (100%)-Отставить на 10 минут 1,0 мл- 1,0 мл(получится 50% раствор) Без инкубации
Р Е З У Л Ь Т А Т:
Отфильтровать Отфильтровать
(NH4)2 SO4(порошок) Прокипятить Добавить соль до насыщения
Р Е З У Л Ь Т А Т:

В Ы В О Д:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 4

РАБОТА № 1. КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

Обоснование выполнения работы. Гидролиз белка – это расщепление биополимера с присоединением воды по месту разрыва пептидных связей под действием кислот, оснований или протеаз. Последовательность гидролиза белка показана на схеме.

В лабораторных условиях гидролиз белков используется для определения первичной структуры, аминокислотного состава белков. Гидролизаты белков применяются в качестве лечебных препаратов при парентеральном питании. В организме человека и животных постоянно происходит гидролиз белков в пищеварительном тракте и клетках органов под действием протеолитических ферментов.

Принцип метода. Большинство биополимеров в реакциях с водой распадаются на мономеры. Гидролиз катализируют протоны, ионы гидроксила и ферменты по механизму нуклеофильного замещения у углерода с карбонильной группой. Полный кислотный гидролиз белков при кипячении происходит в течение 12-96 часов.

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра

Ход работы:

1. В химическую колбу внести 20 мл раствора яичного белка.

¯

2. Добавить 5 мл концентрированной НCl.

¯

3. Отлить 0,5 – 1 мл смеси в пробирку (№ 1), (5 капель).

¯

4. Колбу закрыть резиновой пробкой с длинной стеклянной трубкой (обратный холодильник).

¯

5. Содержимое колбы кипятить под вытяжкой в течение 45 минут.

¯

6. После охлаждения отлить 0,5 – 1 мл гидролизата в пробирку (№ 2) (5 капель).

¯

7. Нейтрализовать содержимое пробирок 20 % NaOH по лакмусу до голубой окраски.

¯

8. Провести биуретовую реакцию в пробирках № 1 и № 2.

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ТРИПСИНА

Обоснование выполнения работы. Протеолитический фермент трипсин осуществляет расщепление пищевых белков в содержимом двенадцатиперстной кишки в верхних отделах тонкого кишечника. Фермент используется также для расщепления белков в лабораторных условиях.

Принцип метода. Протеолитическая активность трипсина регистрируется по количеству освобождающегося аргинина и лизина, которые с фенольным реактивом дают синюю окраску, измеряемую колориметрически.

Ход работы: взять две центрифужные пробирки: контрольную и опытную.

ОТМЕРИТЬ КОНТРОЛЬ О П Ы Т
Раствор белкаФосфатный буферрН 8,0ТХУ, 10 %Раствор трипсина 0,5 мл 1,0 мл2,0 мл0,5 мл 0,5 мл 1,0 мл-0,5 мл
Инкубация 20 минут, при 37оС в термостате
ТХУ, 10 % 2 мл
Центрифугирование 10 минут, 1500 об/мин.Центрифугат перелить в сухие пробирки.
раствор NaOH 0,5 Мфенольный реактив 5,0 мл0,5 мл 5,0 мл0,5 мл
Размешать. Инкубация 20 минут при 18оС

РЕЗУЛЬТАТ:

В Ы В О Д:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 5

РАБОТА № 1. ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Позволяет охарактеризовать одно из свойств ферментов – зависимость протекания ферментативных реакций от температуры (термолабильность).

Принцип метода:

амилаза амилаза

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Крахмал ® декстрины ® мальтоза.

Крахмал дает с иодом синий цвет.

Декстрины дают с иодом фиолетовое, красно-бурое окрашивание.

Мальтоза – желтый (цвет иода в воде).

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки, опыт 1-3. Развести слюну 1 : 10 (1мл слюны в отдельной пробирке + 9 мл Н2О).

ОТМЕРИТЬ ОПЫТ-1 ОПЫТ-2 ОПЫТ-3
Крахмал 1 %Амилаза слюны(разведение 1:10) 0,5 мл0,5 мл 0,5 мл0,5 мл 0,5 мл0,5 мл
Поместить пробирки на 10 минут Комнатнаятемпература (20оС) Термостат(40оС) Кипящая водяная баня(100оС)
Через 10 минут во все пробирки добавить по 1-2 каплиKJ 1%

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

РАБОТА № 2. ВЛИЯНИЕ АКТИВАТОРОВ И ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Активаторы и ингибиторы регулируют действие ферментов. Эти сведения используют для изучения влияния ксенобиотиков и изучения воздействия на энзимы изменяющихся концентраций нормальных метаболитов клетки.

Принцип метода. При активации идет конформационная перестройка активного центра фермента и увеличивается скорость реакции. Ингибиторы оказывают противоположное действие (механизмы различны: через аллостерический центр, путем ковалентного связывания, денатурации и т.д.).

ХОД РАБОТЫ: взять три пробирки: контрольную и две опытные.

ОТМЕРИТЬ КОНТРОЛЬ ОПЫТ 1 ОПЫТ 2
Н2ОNaCl 1 %CuSO4 1 %Амилаза слюны (1: 10)Крахмал 1% 10 капель—20 капель5 капель 8 капель2 капли-20 капель5 капель 8 капель-2 капли20 капель5 капель

¯

Пробирки оставить при комнатной температуре на 5 минут

(10, 15 минут).

¯

Добавить по 2-3 капли раствора йода во все пробирки.

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

РАБОТА № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ (ДИАСТАЗЫ) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ

ПО МЕТОДУ КАРАВЕЯ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ. Определение активности амилазы в моче и сыворотке крови используют для диагностики заболеваний поджелудочной железы.

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении концентрации крахмального субстрата до и после его ферментативного гидролиза. В качестве рабочего раствора используется 0,01 н. раствор йода.

ХОД РАБОТЫ:

Длина волны 630-690 нм (красный светофильтр), кювета с толщиной слоя 1 см.

В 2-х пробирках (опытной и контрольной) проводят анализ согласно таблице:

КОМПОНЕНТЫ ОПЫТНАЯ ПРОБА КОНТРОЛЬНАЯ ПРОБА
Раствор стойкого крахмального субстрата 0,5 мл 0,5 мл
прогреть 5 мин в водяном термостате при 37°С
Негемолизированная сыворотка крови 0,01мл
прогреть 5 мин в водяном термостате при 37°С
Рабочий растворйода (0,01 н.) 0,5 мл 0,5 мл
Дистиллированная вода 4 мл 4 мл
Негемолизированная сыворотка крови 0,01 мл
пробирки встряхивают,и растворы фотометрируют относительно воды

РАСЧЕТЫ. Расчет активности ?-амилазы в г расщепленного крахмала на 1 л сыворотки за 1 час инкубации при 37°С производят по формуле:

Ек – Еоп

Работа № 1. колориметрия, общий принцип. устройство фотоэлектроколориметра Х = ?240

Ек

Ек – экстинкция контрольной пробы;

Еоп – экстинкция опытной пробы.

РЕЗУЛЬТАТ:

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

Активность ?-амилазы в сыворотке крови в норме = 16-30 г/час?л, в моче – 28-160 г/час?л.

Повышение активности фермента наблюдается при паротите, панкреатите, раке поджелудочной железы, перитоните, циррозе печени, остром инфекционном гепатите, внематочной беременности, диабетическом кетоацидозе.

Снижение активности ?-амилазы отмечается при атрофии поджелудочной железы, нарушении фильтрационной функции почек, кахексии.

ВЫВОД:

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 6

Дополнительные материалы:

Колориметрический принцип измерения компонентного состава жидкостей


Похожие статьи: