Практическое применение моноклональных антител

      Комментарии к записи Практическое применение моноклональных антител отключены

.Гибридомиая технология получила в настоящее время широкое применение. Моиоклональные антитела (МАВ) определяют как химический реагент известной структуры, который можно получить по желанию. Их очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с нужным антигеном. Сфера применения МАВ следующая:

1) количественное определение различных веществ;

2) диагностика (идентификация определенного гормона, вирусных, бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов);

3) терапия.

Их можно также использовать в целях пометы и точной идентификации специализированных клеток, таких, как нейроны, чтобы глубже изучить способы их взаимодействия и функционирование. Очень ценны моиоклональные антитела и для изучения клеточных мембран. Они могут выступать и в качестве стандартного реагента для обнаружения определенных молекул на клеточной мембране, а также для разделения популяций клеток, несущих на поверхности разные антигены.

МАВ способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни). В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-мишени. Удалось встроить МАВ в поверхность липосом. Эти липидные пузырьки, способные пересекать клеточную мембрану и переносить миллионы молекул лекарственного препарата, могут оставлять свое содержимое в клетках, против которых специфичны встроенные МАВ. Таким образом, лекарства, противоопухолевые препараты или гормоны могут попадать внутрь клеток, чтобы вылечить их или разрушить.

Иммуноферментный анализ.На основе МАВ был разработан им-муноферментный анализ (ИФА), широко используемый в научных исследованиях и в практике (медицина, сельское хозяйство). Суть его проведения сводится к следующим стадиям:

1) формирование специфического комплекса антиген — антитело;

2) введение в этот комплекс специфической метки;

3) обнаружение комплекса тем или иным способом.

В качестве метки наиболее часто используются ферменты (перок-сидаза, щелочная фосфатаза, сукцииатдегидрогеназа, Р-галактозида-за), продукты реакций которых либо сами окрашены, либо взаимодействуют с хромогенными веществами, меняя их окраску.

ИФА предполагает, что специфический антиген (АП) иммобилизуют на твердом носителе, после чего комплекс обрабатывают антителом (AT), а затем антигеном (АГ2) к этому антителу. При этом ко второму антигену ковалентно пришивают фермент-маркер. Затем этот тройной комплекс необходимо обнаружить. Добавляют субстрат для ферментативной реакции и хромогенное вещество (в случае если продукты реакции не окрашены). По появлению пятен судят о наличии тех или иных моноклональиых антител в исследуемой жидкости.

Практическое применение ИФА.В медицине техника ИФА применяется для диагностики инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются вирусы, простейшие, бактерии, а также для диагностики неинфекционных заболеваний (диабета, рака, сердечно-сосудистых). Используется она и при определении уровня гормонов в организме, а также позволяет контролировать дозировку лекарственных препаратов, выявлять отравления, наличие наркотиков и допингов в организме.

Для диагностики инфекционных заболеваний применяют следующую методику ИФА:

1) связывают исследуемый антиген с нерастворимым носителем;

2) выдерживают иммуносорбентв сыворотке крови пациента;

3) инкубируют полученный комплекс с конъюгатом фермента с античеловеческим антителом какого-либо животного.

При наличии антитела против исследуемого антигена конъюгат связывается с иммуносорбентом и выявляется в реакции с субстратами. Эта методика используется для диагностики бруцеллеза, сифилиса, токсоплазмоза, малярии.

В настоящее время существуют тесты для определения следующих гормонов: инсулина, хориогонадотропииа, кортизона, прогестерона. Они позволяют своевременно обнаруживать эндокринные заболевания, а также выявлять беременность на ранних стадиях. Например, разработан метод определения тиреотропного гормона человека, который регулирует синтез и секрецию гормонов щитовидной железы. Недостаток его приводит к гипотиреозу, а избыток — к ги-пертиреозу. Метод позволяет быстро выявлять больных, а также форму заболевания.

Тест на беременность

С давних пор беременность выявляли на мышах и лягушках, которым вводили мочу пациентов. Гормон беременности — плацентарный хорионический гонадотропин человека (ХГЧ), который появля-

ется в организме женщины на четвертый день после зачатия, вызывает у животных увеличение матки и морфологическое изменение яичников, что и обнаруживается на вскрытии. Иммуноферментный метод определения ХГЧ следующий:

1) антитела к ХГЧ первого типа сорбируют в лунке иммунологической планшетки;

2) добавляют пробу биологической жидкости (кровь или мочу), из которой весь гормон привяжется к антителам;

3) вводят антитела второго типа, меченные ферментом, они также свяжутся с ХГЧ, если, конечно, он есть в пробе. В результате образуется трехслойный «бутерброд»: антитело — гормон — антитело. Поэтому этот анализ еще называют иммуиоферментным сэндвич-методом;

4) добавляют хромофор, происходит обычная иммуноферментная реакция с ферментом-меткой, и лупка желтеет. Таким образом, можно определять ХГЧ в пробе, начиная с концентрации 30 нг/л. При этом сэндвич-метод полностью исключает влияние других гормонов.

На основе этого метода разработаны диагностикумы, определяющие причины бесплодия, время наступления овуляции, найден реальный подход к иммунологическим методам контрацепции.

Благодаря использованию моиоклональных антител, полученных в результате иммунизации животных лекарствами, стало возможным определение дозы этих препаратов. В 1981 г. в США в продажу поступил набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. Разработаны наборы и для токсикологического анализа биологических жидкостей. В сыворотке крови при их помощи можно определить барбитураты, антидепрессанты и другие вещества.

В ветеринарии методы ИФА используют для выявления микробных и вирусных инфекций, для оценки фертильности, контроля качества пищевых продуктов и сырья животного происхождения.

Определение уровня фертильности может быть осуществлено на основании сравнения концентраций различных гормонов в организме животного. Сейчас для оценки репродуктивного цикла коров используют концентрацию гормона прогестерона. Во время овуляции она относительно мала, а затем постепенно возрастает до максимума, изменяясь при этом в крови и молоке коров параллельно, т. е. для анализа можно использовать пробы молока. Если животное стельное, то концентрация прогестерона сохраняется на высоком уровне. Исходя из этого, судят о фертильности животного.

В ветеринарии существует еще ряд проблем, решение которых возможно при использовании техники иммуноферментного анализа:

1) загрязнение пищи анаболическими гормонами;

2) проникновение в молочные и мясные продукты антибиотиков;

3) применение наркотических средств для стимуляции спортивных результатов животных;

4) загрязнение пищи и кормов микотоксинами.

Методика ИФА применяется в диагностике вирусных заболеваний растений: вируса кольцевой пятнистости малины, вируса мозаики картофеля, вируса черной кольцевой пятнистости томатов. С его помощью определяют в пище и кормах растительного происхождения микотоксииы. Например, афлотоксины — группа грибковых токсинов, продуцируемых Asp. flavus. Они поражают семена кукурузы и зерновых культур. Для обнаружения афлотоксинов создан диагностику м.

На мелкозернистом материале иммобилизуют антитела против аф-лотоксина В1. Затем этот комплекс смешивают со стекловолокном, после чего добавляют экстракт, содержащий афлотоксин, меченный пероксидазой хрена, и хлорнафтол. В тех зонах мембраны, где обнаруживается афлотоксин, образуется нерастворимый пурпурный продукт. Анализ проводится за 5 мин.

Кроме того, ИФА применяется при производстве препаратов медицинского назначения и животного сырья, а также для очистки донорской крови.

Терапия опухолей.В 1982 г. были опубликованы открытия Фар-рандсу и его сотрудников (Великобритания). Им удалось получить антитела, специфически узнающие злокачественные опухоли толстой и прямой кишок. Больные получали инъекцию МАВ, меченных радиоактивным йодом. Затем на рентгенограмме определялись истинные размеры первичной опухоли и ее распространение в другие органы.

Харрис и сотрудники (Оксфорд) идентифицировали и выделили Сй/-антитела, распознающие Сй/-антиген, представленный на клеточных мембранах большого числа злокачественных опухолей человека и отсутствующий на клетках доброкачественных опухолей тех же органов и тканей, как и на нормальных клетках. Возможность обнаружения молекулы Ся/-антигена послужила основой для создания метода точной диагностики раковых опухолей. Ее можно обнаружить, когда она состоит из миллиарда клеток. В идеале лечение рака заключается в истреблении малигнизированных клеток без повреждения окружающих здоровых, поэтому весьма ценным качеством противоопухолевого препарата является избирательность его действия. Но противораковые лекарства действуют главным образом на быстро делящиеся клетки, а это делает их неэффективными в отношении медленно развивающихся опухолей. Еще одним способом применения МАВ в терапии рака является соединение их с цитотоксическими веществами.

Такой метод был предложен еще в 1958 г. Ж. Матэ (Франция). Ученый попытался вооружить противоопухолевые антитела анти-неопластическими средствами (метотрексат, хлорамбуцил), однако последние были недостаточно токсичны, а антитела не очищены. Более эффективными оказались яды растительного и микробного происхождения: дифтерийный токсин, рицин (токсин из семян клещевины),

а-аманитин (компонент яда бледной поганки). In vitro эти токсины разрушают нормальные клетки так же, как раковые, поскольку они обладают способностью связываться с поверхностью любых клеток. Поэтому необходима селективность связывания. Рицин состоит из двух полипептидных цепей: А-цепь несет токсические детерминанты, а В-цепь содержит участок, распознающий галактозу, что и позволяет этому токсину связываться с клеточной мембраной. Без В-цепи он приобретал специфичность связывания благодаря антителам и не попадал на нормальные клетки. Начиная с 1978 г. были созданы имму-нотоксины посредством пришивания А-цепи рицина к МАВ. Они распознавали антигены, характерные для новообразований человека. Препятствия к применению иммунотоксинов:

1) возможная их инактивация антителами больных;

2) вероятная нейтрализация опухолевыми антигенами, циркулирующими в крови;

3) неэффективность в случае очень обширного поражения опухолью.

6.3. СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Дополнительные материалы:

Моноклональные антитела против гриппа


Похожие статьи:

  • Практическое применение ифа.

    ИФА нашел широкое применение в различных областях медицины и биологии. ИФА применяется для: диагностики инфекционных заболеваний (выявление специфических…

  • Практическое применение полисахаридов

    В настоящее время полисахариды микроорганизмов достаточно широко используются в практике. Они находят применение в самых различных сферах человеческой…

  • Анатоксины, их получение, титрование и практическое применение.

    Анатоксины (anatoxinum от греч.— «an» — отрицание и toxo» — отравляю) представляют собой препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью…