Получение интерферонов и интерлейкинов генно-инженерными методами

      Комментарии к записи Получение интерферонов и интерлейкинов генно-инженерными методами отключены

Общая характеристика интерферонов и интерлейкинов. Их использование.Цитокины (лимфокииы и монокины) — большая группа белков с молекулярной массой 15 — 20 к Да, вырабатываемых иммунными клетками высших млекопитающих, в том числе и человека. Они обеспечивают правильное взаимодействие между различными клетками и тканями организма. Многие из изученных цитокинов являются колониестимулирующими, или ростовыми, факторами. Другие, к которым, в частности, относятся интерфероны и интерлейкины, участвуют в осуществлении специфических иммунных реакций. Цитокины — потенциальные лечебные препараты, область применения которых возрастает с каждым годом.

Одними из наиболее изученных групп данных белков являются интерлейкины и интерфероны. Интерлейкины — это сравнительно короткие (около 150 аминокислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. Они объединяют две группы, внутри каждой из которых выделяют еще ряд подгрупп. Интер-лейкин-1 образуется определенной группой лейкоцитов крови — макрофагами — в ответ на введение антигена. Он стимулирует размножение других субпопуляций иммунных клеток. Т-хелпер в свою очередь вырабатывает интерлейкин-2, который стимулирует развитие В-лимфоцитов, Т-киллеров и т. д. Под действием интерлейкинов-2 данные субпопуляции вырабатывают другие лимфокины, регулирующие иммунный ответ.

Иптерферопы — это группа белковых веществ, вырабатываемых в организме в ответ на проникновение вируса. Они делятся на три группы. Лейкоцитарный интерферон (а-интерферон) образуется при воздействии вирусов на лейкоциты, фибробластный (р-иитерфе-рои) — при воздействии на фибробласты, иммунный (у-иитерфе-рон) — Т-лимфоцитами в ответ на воздействие вируса. В свою очередь каждая из этих групп включает несколько белков. Все известные иитерфероны типа а у человека не содержат сахарных остатков, тогда как (3- и у-интерфероны гликозилироваиы. Иитерфероны ри а содержат по 166 аминокислотных остатков, а также участвующие в мембранном транспорте лидериые пептиды — соответственно 21 или 23 аминокислотных остатков. а-Интерфероны кодируются семейством из 13 генов, Р- и у-иитерфероны — единственным геном.

Иитерфероны и интерлейкины используются как основные лечебные средства при иммунных расстройствах. Кроме того, первые применяют для лечения болезней, вызываемых вирусами герпеса, бешенства, гепатитов, цитомегаловирусом, вирусом, поражающим сердце, а также для профилактики вирусных инфекций. Также они оказывают лечебное воздействие на организм больных раком и рассеянным склерозом.

Генно-инженерные подходы к синтезу интерферонов. Возможности получения усовершенствованных цитокинов.На практике а-интерферон извлекают из лейкоцитов при низкоскоростиом центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в культуральную жидкость, содержащую либо сыворотку крови человека, либо казеин молока. В среду вносят вирус-интерфероно-геи (вирус Сендай или вирус ныокаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус инактивируют любым из приемлемых способов. Супериатант (от лат. supernatans — плавающий на поверхности), или надосадок, представляет собой нативный интерферон. Его лиофильно высушивают и выпускают в ампулах. Это пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный препарат путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах. После высушивания он имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворим в воде.

р-Интерферон получают из фибробластов, выращенных в мо-нослойной культуре, индуцированной синтетическим фрагментом полиА-полии в присутствии циклогексимида и актиномицииа Д. Обычно иитерфероны продуцируются в малых количествах (около 1 мг на 10 л тканевой культуральной жидкости), и к тому же после 48 — 72 ч клетки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитарных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономически мало выгодных. Поэтому успешно завершившиеся

работы по геино-инжеиерному интерферону помогли решить и эти проблемы. В начале 80-х гг. XX в. британская фирма Wellcome Foundation LTD передала на клинические испытания природную смесь а-интерферонов, полученную в глубинной суспензионной культуре ви-русоиидуцированиых человеческих лимфобластов. Препарат был назван велфероном. Выпускается в виде стерильной, прозрачной, бесцветной жидкости по 1 мл (3 медицинские единицы). К 1988 г. уже три фирмы производили а-иитерфероны.

Технологическая схема получения генно-инженерных иитерфе-ронов (как одна из возможных) принципиально сводится к следующему:

1) индукция синтеза и выделение иитерфероновой мРНК из клеток;

2) получение к ДНК, комплементарной иитерфероновой мРНК из лейкоцитов;

3) встраивание кДНК в плазмиду;

4) введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli;

5) размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду, в культуралыюй среде;

6) сепарирование клеток Е. coli;

7) дезинтеграция и экстракция клеток Е, coli;

8) осаждение (например, полиэтилеиамином) с последующим центрифугированием ;

9) высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфатом;

10) диализ осадка интерферона;

11) растворение интерферона, пропускание раствора через колонку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональиыми антителами);

12) элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике.

Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реализуются в производственных условиях, тогда как первые 4 стадии выполняются в лабораториях.

В первых успешных экспериментах встраивание кДНК в Е. coli приводило к образованию около 50 молекул интерферона на каждую бактериальную клетку. Затем путем точного встраивания иитерфероновой к ДНК рядом с соответствующим бактериальным промотором удалось добиться более высокого уровня экспрессии. Одна из наиболее эффективных конструкций, образованных при слиянии сегмента ДНК, доходящего до инициаторного ко дона и содержащего промотор лактозного оперона, — с последовательностью, кодирующей зрелый человеческий интерферон. Это привело к увеличению количества данного белка, продуцируемого бактериальной клеткой, более чем в 1 000 раз.

Бактерии с генами интерферона человека вырабатывают специфический белок в количестве 200 — 250 мкг/л бактериальной суспензии. Кроме того, удается получать человеческий интерферон с

помощью В, subtilis, способной секретировать синтезируемые белки в окружающую среду, а также с помощью Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и легче сепарируются, в их клетках осуществляется процессииг преиитерфероиов. Применяют также культуры бактерий из родов Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. Все названные микроорганизмы конститутивно (не адаптивно) образуют интерферопы, не отличающиеся от природных. Против всех классов этих белков получены моиоклоиальные антитела, с помощью которых проводят быструю и высококачественную очистку продуктов, применяя иммуноафиииую хроматографию.

Интерферопы ри у также были получены в траисгениых клетках, однако при этом были использованы эукариотические клетки, поскольку прокариотические клетки не имеют систем гликозилироваиия. В качестве продуцентов использовали ооциты лягушки, клетки почек китайского хомячка, клетки дрозофилы, дрожжи и т. д.

Бактериальный интерферон легко очистить, он получен в кристаллической форме и использован в эксперименте на обезьянах. Было показано, что он нетоксичен, поэтому такие испытания провели на людях. В настоящее время предложено множество аспектов использования гешю-иижеиерного а-иитерфероиа. Его разновидности в некоторой степени отличаются по действию на клетки различного происхождения. Эта разница локализуется на генном уровне. Если каждый из соответствующих генов разрезать в определенном месте и выделить вариабельный фрагмент, а затем сшить эти части, то можно получить гибридные гены, которые после трансформации клеток реципиентов будут программировать синтез гибридных иитерферопов. Последние были получены, и показано, что в ряде случаев свойства гибридов резко отличаются от свойств исходных иитерферопов.

Генно-инженерные подходы к получению интерлейкинов. Вцелом схемы получения интерлейкинов и интерферона генно-инженерным методом приблизительно сходны. Отличие заключается в индукторе. На первом этапе моноциты обрабатывают лейкополисаха-ридами (эндотоксинами) грамотрицательных бактерий. Далее из моноцитов выделяют мРНК, из которой вырезают интроны. Экзоны сшивают при помощи лигазы и сшитый фрагмент обрабатывают ре-вертазой с получением к ДНК. На следующем этапе проводится идентификация иитерлейкииа этой кислоты при помощи гибридизацион-иого анализа. Далее его встраивают в фаг А, которым трансформируют клетки Е. coli. На следующем этапе трансформированные клетки размножают при 28 °С, а наработку иитерлейкииа ведут при 42 °С. Затем проводятся его выделение и очистка.

2.3. ПОЛУЧЕНИЕ «БЕЗОПАСНЫХ» ВАКЦИН МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Под общим названием «вакцины» объединяют препараты, способствующие созданию активного иммунитета у людей и животных. Их получают как из самих патогенных микроорганизмов, так и с использованием продуктов их жизнедеятельности. Применение вакцин вызывает выработку невосприимчивости к заражению соответствующим возбудителем и стимулирует защитные силы организма. Поэтому введение этих препаратов может осуществляться как с профилактической, так и с лечебной целью.

Дополнительные материалы:

Сессия 1 Роль пегилированных интерферонов Peter Ferenci


Похожие статьи: