Первые исследования в области генотерапии

      Комментарии к записи Первые исследования в области генотерапии отключены

Первоначально методика трансформации отрабатывалась на животных. В 1981 — 1982 гг. были получены трансгенные мыши, в 1985 г. аналогичные эксперименты проведены на кроликах, свиньях и овцах.

Впервые генная терапия опробована на человеке 22 мая 1989 г. с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы.

Первое успешное клиническое испытание генной терапии было проведено 14 сентября 1990 г. в Бетесде, США: 4-летней девочке, страдавшей редким (1:100 000) заболеванием — тяжелым комбинированным иммунодефицитом, — которое связано с дефектом гена, кодирующего аденозиидезаминазу, была введена нормальная копия гена. Лечение представляло собой поддерживающую терапию, заключавшуюся во включении трансформированных ex vivo (ген АДА + + ген пео + ретровирусиый вектор) лейкоцитов в организм пациента в течение всей жизни с интервалом в несколько месяцев.

Существует несколько подходов к генной терапии. Последовательности ДНК можно вводить как в половые клетки, эмбриональные, так и в соматические взрослого или ребенка.

Трансформация половых клеток предполагает передачу данного гена следующим поколениям. Соображения безопасности и этики препятствуют развитию этого направления. Существует вероятность, что замена одного гена может дезорганизовать работу всего генома. С другой стороны, при достаточной изученности механизмов этого процесса трансформация гамет позволит ограничиться процедурой изменения генома одного больного, не подвергая риску врожденного заболевания его потомство.

Гепотерапия соматических клеток затрагивает только организм самого пациента и разрабатывается как основной подход. Особую роль здесь играет правильный выбор типа клеток, которые должны обеспечить максимально длительное хранение и функционирование внесенного гена.

Пути передачи гена

Разработке программы генной терапии предшествуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распределения белкового продукта, а также биохимический анализ патологического процесса. Апробацию процедуры генокоррекции наследственного заболевания проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционирует данный ген. На клеточных моделях оценивается эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяется экспрессия вводимой генетической конструкции, анализируется ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатываются ее способы коррекции на биохимическом уровне.

Существует два пути передачи лечебного гена.

Заместительная терапия. Если болезнь связана с отсутствием или малым количеством белкового продукта лечебного гена, то достаточно ввести в клетку неповрежденный ген и обеспечить ему условия работы.

Корректирующая терапия. Дефектный ген заменяется нормаль-

ной копией. Этого можно достичь, основываясь на способности молекул ДНК к рекомбинации — обмену участками полинуклеотидных цепей в присутствии специальных ферментов.

Векторы создаются на базе различных вирусов. В 40 % случаев используются аденовирусы, включая делетированиые, в 30 % — рет-ровирусы, в 16 /о — аденоассоциированные вирусы, в 10 % — вирус простого герпеса, в 4 % — лентавирусы, вирус папилломы, гибридные вирусные конструкции, в том числе на базе вирусов простого герпеса и аденоассоциированного. Вирусы различаются способностью встраиваться или не встраиваться в геном и соответственно длительной или кратковременной экспрессией в клетках, а также специфичностью (тропизмом) к определенным тканям и органам.

Введение гена в клетку

Имеется два способа. Генетическая модификация может проводиться непосредственно в организме больного или путем внесения функционального гена в предварительно выделенные и культивиру-емые клетки пациента, возвращенные обратно. Второй метод приме-няется чаще ввиду его эффективности.

Для переноса генов в ткани организма осуществляется обычная инъекция чистой ДНК. Предложены также другие, более прогрессивные методы.

Из физических методов применяется бомбардировка частицами, когда ДНК наносится на микроскопические металлические дробинки и выстреливается в клетку.

Достаточно эффективным способом является внесение ДНК в комплексе с липосомами — искусственными мембранными пузырьками, которые сливаются с плазмалеммой.

Предполагается также использовать комплексы ДНК с белками (трансферрин), для которых на поверхности клетки имеются специ-фические рецепторы, после связывания с ними чужеродная ДНК вме-сте с белком будет поглощена клеткой-мишенью.

Некоторые ученые предлагают ассоциировать плазмидную ДНК с солями и органическими полимерами (ДЭАЭ-декстран, полилизин). Активно используется природная способность вирусов проникать в клетки и привносить в них собственный генетический материал, на основе которого на сегодняшний день создано множество генно-инженерных конструкций — векторов: ретровирусные, аденовирусные и др.

Особое внимание уделяется созданию векторов на основе искус-ственных хромосом млекопитающих {Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы.

Многие лаборатории развивают невирусные подходы к доставке

генов. Это простые системы, и в них можно помещать сколько угодно большие ДНК. Успешная доставка длинной нестабильной полианионной молекулы ДНК в клетку-мишень через три липидных би-слоя, т. е. клеточную мембрану и двойную ядерную мембрану, требует специальных ухищрений.

Во второй стратегии используют имитацию вирусов. В этом случае ДНК вводят в комплекс с поликатионом (например, полилизином), лигандом для связывания с клеткой и инициации эндоцитоза (таким лигандом может быть, например, трапсферрин или антитело, специфичное к какому-либо поверхностному белку клетки) и специальным агентом, облегчающим высвобождение ДНК из этого комплекса и эндосом в цитоплазме. Такие агенты называют эндосомоли-тическими. Ими могут служить репликациоино-дефектные аденовирусные частицы, включаемые в комплекс. Для увеличения безопасности таких систем пытаются использовать аденовирусы животных, неспособные реплицироваться в человеческих клетках. Лиганд, введенный в комплекс, определяет клеточную специфичность доставки ДНК.

При некоторых достоинствах системы невирусной доставки имеют и серьезные недостатки. Требуется очень высокая концентрация частиц, чтобы перенос гена осуществился. Пока неясно, как обстоит дело с проблемами безопасности при их использовании. До настоящего времени эти системы испытывались на людях только в стратегии in vivo. Многие склонны считать, что идеальными для целей генной терапии соматических клеток были бы векторы, имитирующие хромосому человека. Они могли бы быть созданы по образу и подобию природных хромосом, так же, например, как дрожжевые искусственные хромосомы — YAC. Для этого векторы должны содержать два функциональных элемента: участок, ответственный за репликацию (origin of replication), и последовательность, обеспечивающую мито-тическую стабильность, или центромеру. Полагают, что такие искусственные хромосомы для клеток млекопитающих появятся в ближайшее время.

Дополнительные материалы:

Вечная молодость: вся правда о последних экспериментах генной терапии


Похожие статьи: