Методы, применяемые при вирусологических исследованиях, которые способствовали прогрессу в познании природы вирусов

      Комментарии к записи Методы, применяемые при вирусологических исследованиях, которые способствовали прогрессу в познании природы вирусов отключены
Методы культивирования Физические методы Биохимические методы Иммунологические методы Генетические методы
Культивирование в животных и растительных организмах Фильтрация через бактериальные фильтры (Шамберлана и др.) Высаливание вирусов (кристаллизация вирусов сернокислым натрием и др.). Реакция гемагглютинации, торможения гемагглютинации, нейтрализации и др. Методы и системы для изучения литических взаимодействий фагов и бактерий
Культивирование в куриных эмбрионах Ультрацентрифугирование Биохимический анализ структуры вирусных ДНК, генов, РНК, белков Использование моноклональных антител Картирование генов с использованием ферментов рестрикции
Культуры клеток(эксплантируемые, первично перевиваемые, полуперевиваемые, перевиваемые) Гель-электрофорез Анализ транскрипции, трансляции генетической информации и синтеза белка Радиоиммунный метод Цепная полимеразная реакция, генные зонды
Методы количественного и качественного учёта при культивировании в культурах клеток (метод бляшек, цветная проба) Электронная микроскопия Анализ точечных генных мутаций Иммуноферментный анализ, иммуноблотинг Тесты рекомбинации, комплементации

Методы культивирования вирусов. Выделение и изучение в лабораторных условиях групп вирусов было ограничено возможностями моделей и методов, имевшихся в распоряжении исследователей.

Начиная с работ Л. Пастера по бешенству (1880 г.), и до 1949 г. основной экспериментальной моделью для изучения вирусов являлись животные (собаки, кролики, обезьяны, морские свинки), растения, бактерии, а в отдельных случаях – люди.

В 1928 г. англичанин Адриан Стоукс установил восприимчивость к жёлтой лихорадке обезьян вида Maccacus rhesus. Это открытие избавило исследователей от необходимости проводить эксперименты на себе и добровольцах.

В 1930 г. М. Тейлеру удалось инфицировать белых мышей, вводя вирус в их мозг, а не подкожно, как это делали другие исследователи. Штаммы вирусов, культивируемых на мышах, стали основой для получения двух вакцин. Первая, ослабленный мышиный штамм, была использована в 1934 г., но наряду со своей эффективностью, иногда вызывала энцефалит.

Белые мыши становятся основной лабораторной моделью в период с 1930 по 1940 гг. На них с успехом были изолированы и культивированы вирусы японского энцефалита (Кавамура, 1936 г.), гриппа (Эндрюс и Френсис, 1934 г.), герпеса, вирусов Коксаки (Долдорф и Сиклис, 1948 г.). Важным обстоятельством было то, что у мышей наблюдались клинические симптомы заболевания.

В 1937 г. во время экспедиции на Дальний Восток группой российских вирусологов во главе с Л.А. Зильбером (1894-1966 гг.) была изучена этиология и эпидемиология русского весенне-летнего (клещевого) энцефалита. С помощью внутримозгового заражения мышей и макак резус удалось выделить штаммы высоковирулентных нейротропных вирусов клещевого энцефалита, близко родственных между собой по биологическим и антигенным свойствам. Были начаты работы (Н.В. Каган, А.А. Смородинцев) по созданию вакцины. В 1938 г. на территории Дальнего Востока был выделен вирус японского энцефалита (А.А. Смородинцев, А.К. Шубладзе, Е.Н. Левкович). Результаты экспедиции заложили основу для изучения краевой патологии. В 1938-39 гг. Е.Н. Павловский, обобщив экологические закономерности клещевого энцефалита и ряда других трансмиссивных инфекций, создал учение об их природной очаговости.

Однако метод культивирования вирусов на животных имел существенные недостатки: 1) нельзя было получить достаточно очищенную от тканей и концентрированную культуру вирусов; 2) под влиянием экспериментальной инфекции могли активизироваться латентные вирусы, присутствовавшие в организме животных и, таким образом, приходилось работать со смесью двух вирусов; 3) некоторые вирусы человека не удавалось адаптировать к организмам животных. Отсутствие более универсальных методов культивирования вирусов тормозило развитие науки.

Значительный прогресс в вирусологии был связан с введением в вирусологическую практику метода культивирования вирусов в куриных эмбрионах, разработанного в 1931 г. Р. Гудпасчером и Вудраффом. Пользуясь этим методом, удавалось получить в лабораторных условиях более широкий круг вирусов; надёжней и качественней стала очистка вирусных культур, можно было получать вирусы в более высоких концентрациях, чем при заражении животных.

Используя куриные эмбрионы, М. Тейлер и его коллеги получили второй штамм вируса жёлтой лихорадки, обозначенный как штамм 17Д. Вакцина из этого штамма была ареактогенна и более лёгкая для массового производства. С 1937 г. она стала широко использоваться, и оказалась весьма эффективной для борьбы с жёлтой лихорадкой. За открытия, связанные с этой болезнью, и борьбу с ней М. Тейлер был удостоен Нобелевской премии в области физиологии и медицины (1951 г.). В последующем, используя куриные эмбрионы, были получены многие другие вакцины.

Третьим и в настоящее время основным методом выделения и культивирования вирусов является метод тканевых культур. Первые работы по использованию культур тканей были выполнены с вирусом полиомиелита (Левадити, 1914 г.), саркомы Роуса (Кэррел, 1924 г.), герпеса (Рейверс, 1929 г.), ветряной оспы (А. И. Тогунова и О. И. Бронштейн, 1935 г.), кори (П. В. Смирнова и сотрудники, 1935 г.). При этом использовали растущие культуры тканей в виде их эксплантатов (по Кэррел-Бероуз, 1910 г.) или переживающую культуру ткани (по Мейтленд, 1928 г.) в виде её кусочков, взвешенных в питательной среде. Однако применение небольших объемов тканевых эксплантатов, отсутствие антибиотиков и методов индикации вирусов в культивируемой ткани тормозило её широкое использование.

В начале 1947 г. Джон Эндерс (1897-1985 гг.) и его коллеги Фредерик Ч. Роббинс (род. 1916 г.) и Томас Х. Уэллер (род. 1915 г.), исследуя размножение вирусов в культуре тканей человека, разработали методику непрерывной культуры. Вместо того чтобы через интервалы в 3-4 дня переносить материал из одной культуры в другую, они сохраняли ткани, обновляя питательную среду. Благодаря этому методу, а также использованию пенициллина и стрептомицина, удавалось поддерживать клетки культуры в течение месяца. В 1948 г. Д. Эндерс, Ч. Роббинс и Т. Уэллер получили рост вируса полиомиелита не в культуре нервной ткани человека. В то время считалось, что этот вирус может расти только в нервных клетках. Кроме того, учёные разработали новые методы выращивания клеток в твёрдом слое (а не в жидкости), контроля за размножением вирусов и использования вируссодержащих клеточных культур для проверки антител к вирусу полиомиелита. В 1954 г. Д. Эндерсу, Ч. Роббинсу и Т. Уэллеру была присуждена Нобелевская премия — за открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных типов тканей.

Использование культуры человеческих тканей позволило приступить к решению многих проблем вирусологии, что раньше было невозможно из-за отсутствия восприимчивых лабораторных животных. Спустя некоторое время методы Д. Эндерса, Ч. Роббинса и Т. Уэллера были использованы Джонасом Солком, Альбертом Сэйбином и другими учёными, получившими вакцину против полиомиелита. Были также созданы возможности интенсивной репродукции и непосредственной индикации накопления вирусов по развитию отчётливо выраженных морфологических изменений в тканевой культуре. Открылась возможность их непосредственной идентификации в культуре клеток с помощью специфических иммунных сывороток.

Трипсинизация тканей, предложенная Р. Дульбекко и Вогтом (1952 г., 1954 г.) и Джогнером (1954 г.) для получения однослойных первичных и перевиваемых культур облегчила дальнейшую работу с культурами клеток. Это позволило изолировать группы вирусов, не известных или ранее не поддававшихся культивированию из-за того, что к ним были не чувствительны белые мыши и другие лабораторные животные, а также развивающиеся куриные эмбрионы. По цитопатическому эффекту были выявлены вирусы ЕСНО, реовирусы, аденовирусы, респираторно-синцитиальный вирус. Использование метода тканевых культур одновременно с феноменом гемадсорбции дало возможность изолировать группу парагриппозных вирусов (Ченок, 1956 г.). В последующем была изолирована группа риновирусов, которым, как оказалось, необходимы для культивирования пониженная температура, определённая рН среды и вращение инфицированных культур (Тирреле, 1960-62 гг.).

В настоящее время в вирусологическую практику вошли методы культивирования и клонирования различных субпопуляций Т-лимфоцитов. На таких культурах проводится выделение и идентификация вирусов, растущих в лимфоидных клетках данного типа, например, вирус Т-клеточного лейкоза человека, вирус иммунодефицита человека.

Физические методы выделения и обнаружения вирусов. Фильтрация через бактериальные фильтры использовалась в вирусологической практике вплоть до 1940-х гг.

Применив указанный метод, Р. Коул и А. Куттнер в 1926 г. обосновали вирусную природу цитомегалии у грызунов путём заражения морских свинок ультрафильтратами мочи от больных животных. В 1933 г. английские вирусологи В. С. Смит, С. Н. Эндрюс и Р. Лейделоу, вводя белым африканским хорькам фильтрованный материал, полученный от больных гриппом, установили его вирусную природу.

После того, как бельгийско-американский биолог Альбер Клод в 1974 г. разработал метод дифференциального ультрацентрифугирования, данный метод стал широко использоваться для получения вирусов в чистом виде и идентификации их составляющих. Это способствовало более подробному изучению путей сборки вирусной частицы.

Гель-электрофорез в полиакриламидном геле позволил разделять белковые смеси. Первоначально это было сделано с вирусом полиомиелита, а затем с более сложными вирусами и культивируемыми клетками.

Значительный прогресс в изучении ультраструктуры вирусов был связан с использованием в вирусологии метода электронной микроскопии.

Самый первый электронный микроскоп был сконструирован в 1931 г. немецким физиком Эрнстом Августом Руска (1906-1988 гг.) и его коллегой Кноллем. В конце 1920-х гг. Э. Руска, открыв, что магнитная катушка может действовать, как линза для электронов, сумел построить магнитные линзы с таким коротким фокусным расстоянием, что их можно было использовать для получения объекта, облучённого электронами. В 1933 г. Э. Руска принимал участие в разработке первого серийного электронного микроскопа с разрешающей способностью 100 A, который впервые поступил на рынок в 1939 г. Разработанный Э. Руска электронный микроскоп был просвечивающим (трансмиссионным), и применялся в самых различных областях науки, в том числе при исследовании бактерий, вирусов, белковых молекул и других биологических структур. Благодаря применению электронной микроскопии Э. Руска в 1940 г. впервые описал структуру вируса натуральной оспы.

Изобретённый Э. Руска просвечивающий микроскоп стимулировал разработку электронных микроскопов других типов, наиболее важным из которых является сканирующий электронный микроскоп. Он был сконструирован немецким физиком Гердом Биннигом (род. 1947 г.) и швейцарским физиком Гейнрихом Рорером (род. 1933 г.), и испытан весной 1981 г. Сканирующий электронный микроскоп позволял получить объёмное изображение объекта, в отличие от плоскостного изображения при использовании трансмиссионного электронного микроскопа. В настоящее время существуют трансмиссионные электронные микроскопы, способные разрешать деталь размером 1 A и сканирующие электронные микроскопы с разрешающей способностью по вертикали до 0,1 A (около 0,1 диаметра атома водорода), а по горизонтали – в 2 A. Сканирующие электронные микроскопы и сейчас широко применяются для изучения вирусов. За фундаментальные работы по электронной оптике и создание электронных микроскопов Э. Руска, Г. Бинниг и Г. Рорер были удостоены Нобелевской премии 1986 г.

Широкое использование электронных микроскопов при вирусологических исследованиях позволило учёным разных стран увидеть вирусы и изучить их строение. В 1953 г. В. Миндер, используя электронный микроскоп, впервые обнаружил цитомегаловирусы человека. В 1956 г. работами Ф. Крика и Д. Ватсона было установлено, что вирусные капсиды бывают спиральными и икосаэдрическими. В 1962 г. при использовании электронной микроскопии Д. Каспар и А. Клаг сформулировали основные принципы сборки вирусов. В 1970 г. Д. С. Дейн и С. Н. Камерон методом электронной микроскопии открыли вирус гепатита В, названный «частицами Дейна». В 1979 г. М. Фейстоун методом иммунной электронной микроскопии обнаружил вирус гепатита А.

В конце 1960-х гг. американский педиатр и вирусолог Дениэл Карлтон Гайдузек (род. 1923 г.), используя метод электронной микроскопии, открыл прионы (сокращённо от английского термина proteinaceus infectious particles) – инфекционные белки, представляющие собой принципиально новые болезнетворные агенты ранее неизвестной категории человеческих болезней (медленные инфекции).

В результате изучения куру, начатого в 1958 г., Д. Гайдузек установил, что заболевание характеризуется длительным инкубационным периодом, не сопровождается иммунной реакцией и выработкой интерферона. Наиболее поразительные свойства относились к строению прионов. Они не образовывали вирусоподобных частиц, видимых в электронный микроскоп, не имели нуклеиновых кислот, что доказывалось нечувствительностью прионов к нуклеазам, ультрафиолетовому облучению и высокой температуре, которые разрушают нуклеиновые кислоты и лишают большинство вирусов инфекционных свойств. Вместе с тем, прионы были чувствительны к ферментам, разрушающим белки. При электронной микроскопии в головном мозге людей, умерших от куру, обнаруживались небольшие белковые тяжи, которые, как полагал Д. Гайдузек, являлись причиной болезни, то есть прионами. Все эти факты убедили Д. Гайдузека и других учёных, что прионы – медленные вирусы, представляющие собой принципиально новый тип инфекционного агента. Белковые тяжи при куру были поразительно схожи со структурами, образующимися в мозге индивидуумов, страдающих болезнями Крейтцфельдта-Якоба, Альцтгеймера, а также с рядом нейродегенеративных заболеваний животных. За открытие возбудителей ранее неизвестной категории болезней человека Д.К. Гайдузек в 1976 г. был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Биохимические методы изучения вирусов.Подлинную революцию в вирусологии совершил американский биохимик Уэнделл Мередит Стэнли (1904-1971 гг.).

В 1932 г. он приступил к исследованию возбудителя мозаичной болезни табака, которого получил в кристаллическом виде повторным высаливанием сернокислым аммонием. Подвергнув выделенные кристаллы действию ферментов трипсина и пепсина, а также более 100 других химических реагентов, У. Стэнли к 1934 г. пришёл к заключению, что вирус табачной мозаики состоит, главным образом, из белка. В 1935 г. ему удалось методом высаливания получить в кристаллическом виде вирусный белок, а затем доказать, что эти кристаллы можно растворить, профильтровать, очистить и вновь кристаллизовать, не нарушая их способности размножаться в растениях и заражать их. У. Стэнли пришёл к выводу, что вирус табачной мозаики представляет собой белковую молекулу. Значение этого достижения было чрезвычайно велико. Оно открыло путь к выделению в чистом виде многих других растительных и бактериальных вирусов и углублённому изучению их строения и свойств. За получение в чистом виде вирусных белков У. М. Стэнли была присуждена Нобелевская премия в области химии (1946 г.).

В 1937 г. английские биохимики Фредерик Боуден и Корман У. Пайри установили, что в вирусе табачной мозаики содержится 5 % нуклеиновой кислоты. Этим было доказано, что вирус мозаики табака представляет собой нуклеопротеид.

В 1953 г., после того, как Нобелевские лауреаты 1962 г. Ф. Крик, Д. Уотсон и М. Уилкинс расшифровали химическую структуру ДНК, стало возможным понять не только, как эта молекула воспроизводится, но и каким образом содержащийся в ней генетический код обусловливает наследование свойств организма. Исходя из двухниточной спиральной модели ДНК, стало ясно, что мутации возникают в результате потери или замены в молекуле ДНК пурино-пиримидиновых оснований.

В конце 1950-х гг. Франсуа Жакоб (род. 1920 г.) и Жак Моно (1910-1976 гг.) доказали существование информационной РНК, переносящей генетическую информацию от ДНК ядра клетки к синтезу белка на рибосомы. Транспортная РНК переносит к рибосомам структурные компоненты белков – аминокислоты. Кроме того, Ф. Жакоб и Ж. Моно обнаружили, что в ДНК содержатся 2 различных типа генов – структурные и регуляторные. Структурные гены отвечают за передачу генетического кода от одного поколения клеток к другому, а также управляют синтезом белков. Регуляторные гены взаимодействуют со структурными и регулируют все биохимические процессы в клетке, позволяя ей тем самым приспосабливаться к изменениям окружающей среды, например, к изменениям количества и качества поступающих в неё питательных веществ. Совокупность структурных и функциональных генов была названа опероном, а ген, отвечающий за репрессию и активацию оперона – геном-оператором.

При использовании биохимических методов и методов молекулярной биологии было доказано наличие нейраминидазной активности у вируса гриппа и лизоцимоподобных ферментов в хвостах бактериофагов. В 1960-е гг. и в начале 1970-х гг. был открыт ряд ферментов вирусов, в том числе РНК-полимераза у вируса осповакцины и РНК-вирусов (Д. Кэйтс, Б. Р. Макауслэн, 1967 г.). В 1976 г. А. Д. Шаткин обнаружил ферменты, осуществляющие кэппинг мРНК. Современными методами биохимии у вирусов животных были выделены полиадениловые последовательности на 3′-конце мРНК (Д. Кэйтс, 1970 г.) и сплайсинг (М. Бержет, 1977 г.). Сигнальные последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию эукариотических мРНК, в ряде случаев впервые были определены для вирусных мРНК (М. Козак, 1978 г.).

Генетические методы изучения вирусов.В 1937 г. немецко-американский молекулярный биолог Макс Дельбрюк (1906-1981 гг.) предложил рассматривать гены как молекулы, а репликацию вирусов – как особую форму примитивной репликации генов. Такая точка зрения упрощала вопрос о происхождении многих чрезвычайно сложных и специфических молекул, имеющихся в каждом организме и необходимых для осуществления наиболее простого обмена веществ. Заинтересовавшись генетикой бактериофагов, М. Дельбрюк и биолог Эмори Эллис разработали экспериментальные методы изучения бактериофагов, а также математическую систему для анализа результатов своих экспериментов. В 1939 г. они опубликовали данные изучения одиночного цикла размножения фага в отдельных клетках. Эта работа положила начало новой эре в исследованиях вирусов.

В 1943 г. М. Дельбрюк совместно с итало-американским биологом Сальвадором Лурия (1912-1991 гг.) сообщили, что ДНК бактериальной клетки подвергается спонтанным мутациям, что влияет на её резистентность по отношению к лизису бактериофагами. Данные учёных опровергали мнение о приобретении генетических черт, и являлись первым доказательством передачи наследственности через гены.

В 1946 г., работая независимо друг от друга, М. Дельбрюк и американский биолог Альфред Херши (род. 1908 г.) выявили возможность обмена генами между двумя различными линиями бактериофагов, если одна и та же бактериальная клетка инфицируется несколькими бактериофагами. Этот феномен, названный генетической рекомбинацией, был первым экспериментальным доказательством рекомбинации ДНК в вирусах.

В 1950 г. С. Лурия опубликовал неопровержимые доказательства того, что гены бактериофагов (и вирусов) претерпевают спонтанные мутации и этот процесс сходен с таковым у бактерий.

В 1952 г. А. Херши с генетиком Мартой Чейз обнаружил, как бактериофаги поражают бактериальные клетки. Использованный А. Херши и М. Чейз метод исследования был основан на факте, что в белке фага не содержится фосфор, а его ДНК не содержит серу. После культивирования 2 партий бактериофага – одной с радиоактивным фосфором, другой – с радиоактивной серой – были прослежены пути изотопов в процессе взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой. Было установлено, что бактериофаг сначала прикрепляется к мембране бактерии своим белковым хвостовым отростком, а находящаяся внутри фага нуклеиновая кислота вводится затем в бактериальную клетку. Для отделения свободных оболочек бактериофагов, содержащих изотоп серы, от бактериальных клеток, меченных фосфором, суспензию помещали в смеситель и перемешивали для того, чтобы разрушить прикрепление хвостовых отростков фага к бактериальным мембранам. На следующем этапе суспензию прогоняли через центрифугу для отделения клеточной фракции от жидкой. Результаты этих экспериментов подтвердили, что ДНК является генетическим материалом бактериофага, следовательно, и всех других организмов. Вслед за этим было установлено, что вирусы содержат либо ДНК, либо РНК.

В течение 1950-60-х гг. А. Херши изучал биохимическую структуру и функцию ДНК бактериофага и доказал, что его ДНК представлена одной нитью – в отличие от ДНК высших организмов, а некоторые ДНК бактериофагов имеют кольцевую структуру. Кроме того, ДНК одних вирусов отличается от ДНК других вирусов. За открытия, касающиеся механизма репликации и генетической структуры вирусов, А. Херши, С. Лурия и М. Дельбрюку была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине в 1969 г.

В 1956 г. в области вирусологии было совершено ещё одно крупное открытие: химически чистая нуклеиновая кислота, выделенная из вируса и введенная в чувствительные организмы, вызывала у них заболевание, а в клетках синтезировался вирус целиком на основе введенной нуклеиновой кислоты. Об этом открытии одновременно сообщили А. Гирер и Г. Шрамм, а также американец Н. Френкель-Конрад. Им удалось извлечь РНК из вируса табачной мозаики и вызвать заболевание табачных растений, прививая им эту нуклеиновую кислоту. Опыты А. Гирера, Г. Шрамма и Н. Френкеля-Конрада революционизировали представления о способе размножения вирусов. До 1956 г. никто не мог сказать, как именно размножается вирус в клетке, в которой он паразитирует; огромное большинство вирусологов считало, что вирусы размножаются подобно бактериям путём прямого деления (амитоз). Исследования А. Герера, Г. Шрамма и Н. Френкеля-Конрада, как и других вирусологов, доказали, что элементом, играющим главную роль в размножении вирусов, является их нуклеиновая кислота – РНК или ДНК. Нуклеиновая кислота вируса проникает клетку, в которой он паразитирует, и инициирует там ряд патологических процессов. Вирусная нуклеиновая кислота заставляет клетку прекратить производство собственных нуклеиновых кислот и начать производить нуклеиновые кислоты, тождественные с кислотами вируса, то есть нуклеиновая кислота вируса представляет для клетки образец, в соответствии с которым клетка обязана производить такие же нуклеиновые кислоты, какие имеет проникший вирус. Таким образом, вирус не производит себя сам подобно бактериям, а воспроизводится клеткой, в которой паразитирует.

В 1950 г. французский микробиолог Андре Мишель Львов (род. 1902 г.) при поддержке Ф. Жакоба и Ж. Моно, изучая лизогенные бактерии и процесс лизогении, сделал выдающееся открытие. Было обнаружено, что при заражении бактерий фагами ДНК последних способна встраиваться в ДНК бактерии и вести себя как бактериальный ген (стадия профага). В этой стадии активность структурного гена профага подавляется регуляторным геном, в результате чего фаговая частица не может размножаться. При действии ультрафиолетового излучения и других стимуляторов влияние гена-регулятора нейтрализуется, вызывая размножение фага и разрушение бактериальной клетки. Результаты этого исследования позволили А. М. Львову высказать гипотезы о природе рака и полиомиелита. Он и его коллеги Ф. Жакоб и Ж. Моно были убеждены в вирусной этиологии рака. По их мнению, вирусы могут так же располагаться в клетках человеческого организма, как частицы бактериофага в бактериальных клетках. А. М. Львов правильно констатировал, что канцерогенные свойства вируса определяются белковой оболочкой, а канцерогенное действие вируса может быть спровоцировано влиянием разнообразных факторов – так же, как стадия профага может стать лизогенной под действием ультрафиолетового излучения. В ходе исследований Ф. Жакоб, Ж. Моно и А. М. Львов установили, что в ДНК бактериофагов содержатся как структурные, так и регуляторные гены. За открытия, связанные с генетическим контролем синтеза ферментов и вирусов, А. М. Львов в 1965 г. разделил Нобелевскую премию в области физиологии и медицины с Ф. Жакобом и Ж. Моно.

В 1962 г. швейцарский молекулярный биолог Вернер Арбер (род. 1929 г.) выявил механизм «ограничения, вызванного клеткой-хозяином», или рестрикции-модификации. При этом процессе ДНК бактериофага расщепляется на фрагменты под действием рестрикционного фермента – эндонуклеазы, действующего совместно с метилазой. При этом бактериальная эндонуклеаза распознаёт определённую последовательность нуклеотидов в бактериофагальной ДНК и в соответствующих участках расщепляет эту ДНК, тем самым инактивируя её. Метилаза распознаёт такую же последовательность в ДНК бактериальной клетки, метилирует её и тем самым предохраняет от ферментативного разрушения собственной эндонуклеазой. В. Арберу не только удалось выделить и очистить эндонуклеазу и метилазу, но также обнаружить бактерии-мутанты, у которых оба эти фермента были дефектны. В. Арбером была изучена дефектная эндонуклеаза типа I, которая, хотя и распознаёт специфические нуклеотиды бактериофагальной ДНК, расщепляет её в самых различных участках. Учёный предсказал, что должны существовать и эндонуклеазы типа II, действующие именно на тот участок, который они распознают, а также что они позволят осуществлять точный анализ генной структуры ДНК, и что такого рода расщепление генов когда-нибудь станет обычным методом.

В 1967 г. американский молекулярный биолог Гамильтон Смит (род. 1931 г.) выделил и очистил рестрикционную эндонуклеазу II типа, а также впервые идентифицировал специфичную, то есть действующую на определённые участки, эндонуклеазу. Кроме того, была установлена специфическая нуклеотидная последовательность ДНК, которую распознаёт этот фермент, и тот участок, на который он действует. Г. Смит также показал, что открытый им фермент может расщеплять чужеродную ДНК.

В 1969 г. американский молекулярный биолог Даниэл Натанс (род. 1928 г.), используя открытую Г. Смитом рестрикционную эндонуклеазу и эндонуклеазу II типа, впервые расщепил молекулу ДНК вируса обезьян, идентифицировав отдельные части, и создал карту мест расщепления. Далее было установлено соответствие локализации и функции специфических генов и разработана первая детальная генетическая карта молекулы ДНК, включая сайты (участки) начала и окончания процесса репликации. Кроме того, была определена нуклеотидная матрица для информационной РНК и локализация генов, направляющих синтез белков оболочки вируса. В 1978 г. В. Арбер, Г. Смит и Д. Натанс были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине за открытие ферментов рестрикции и методов их использования для изысканий в молекулярной генетике. Разработанные Д. Натансом методы анализа генетической структуры позднее были использованы для генетического картирования более сложных молекул ДНК, а также для разработки методов рекомбинации ДНК с целью создания бактериальных “фабрик”, синтезирующих необходимые для медицины препараты (инсулин, гормон роста, интерфероны и др.). Так возникло новое направление генетики – генная инженерия. Первую рекомбинантную молекулу ДНК получил в 1972 г. американский учёный П. Берг.

Иммунологические методы исследования природы вирусов. В 1941 г. американский учёный Г. Хёрст открыл феномен гемагглютинации, что значительно способствовало изучению взаимодействия вируса с клеткой. С помощью гемагглютинации, или склеивания эритроцитов, можно было производить быструю проверку на присутствие вируса, поверхностные белки которого вызывают агглютинацию эритроцитов. Этот метод сыграл важную роль в изучении вирусов и в развитии методов их количественного определения. Феномен агглютинации эритроцитов был впервые обнаружен при изучении вируса гриппа; впоследствии он был отмечен и у многих других вирусов.

Существенно расширила возможности вирусологических исследований разработка американских учёных – биофизика Розалин Сасмен Ялоу (род. 1921 г.) и врача Соломона Берсона радиоиммунного метода, включающего использование радиоактивных веществ для измерения содержания различных субстратов в биологических объектах. После опубликования описания метода в 1959 г. Р. С. Ялоу, наряду с другими исследованиями, использовала метод для прослеживания пути лейкозных вирусов на стадиях до развития опухоли. За развитие радиоиммунных методов Р. С. Ялоу в 1977 г. была удостоена Нобелевской премии по физиологии и медицине. В 1960-е гг. радиоиммунный анализ стал мощным инструментом быстрой высокочувствительной идентификации и анализа вирусов иммунологическими средствами.

С 1960-х гг., в связи с широким использованием гемотрансфузии и парентеральных вмешательств, заболеваемость в мире сывороточным гепатитом приняла характер эпидемии. Болезнь нередко протекала крайне тяжело, переходила в хроническую форму и даже приводила к развитию рака печени. В 1963 г. американский врач и учёный Барух Самуэль Бламберг (род. 1925 г.) сделал неожиданное открытие, выделив из крови больного гемофилией, жившего в Нью-Йорке, антитела, реагирующие только с антигенами сыворотки, полученной от австралийского аборигена. Этот сывороточный антиген был назван «австралийским». В последующем выяснилось, что этот антиген связан с вирусом гепатита В, однако сам вирус гепатита В выявить не удалось. Он не выращивался в культурах клеток тех типов, которые разработал Д. Эндерс для изучения полиомиелита, и поражал лишь человека и шимпанзе. Хотя и было установлено, что гепатит В может передаваться при переливании крови, до Б. Бламберга не существовало способа определения наличия вируса в крови. Только после того, как Б. Бламберг установил связь между австралийским антигеном, были разработаны программы определения вируса в консервированной крови, что снижало риск одного из главных осложнений при её переливании. В 1976 г. Б. С. Бламбергу за открытие австралийского антигена вируса гепатита В была присуждена Нобелевская премия. Открытие Б. С. Бламберга позволило не только идентифицировать вирус гепатита В в крови по наличию в ней австралийского антигена (современное название – «поверхностный» антиген HВsAg), но и произвести генно-инженерную вакцину.

С помощью появившихся в последнее десятилетие моноклональных антител стала возможной идентификация специфических областей вирусных белков. Благодаря этому в распоряжении вирусологов оказался чрезвычайно чувствительный иммунологический тест.

Среди различных подтверждающих методов наибольшее распространение в последнее время получил иммуноблот. Этот метод сочетает фракционирование белков вирусов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, электрофоретический перенос белков из геля на нитроцеллюлозную бумагу с последующей индикацией белковых фракций иммуноферментным методом.

Изучение вирусного онкогенеза.Большую роль в развитии экспериментальной онкологии сыграл впервые установленный М. А. Новинским (1876 -1877 гг.) и воспроизведённый Ганау (1889 г.) факт переноса опухолей от одного животного к другому. Вместе с тем, представление о том, что перенос опухоли может быть осуществлён только клетками, оказалось имеющим ограниченное значение.

Мысль о том, что раковые опухоли могут быть вызваны агентом вирусной природы, впервые была высказана Боском (1903 г.) и Боррелем (1903 г.).

Американский патолог Френсис Пейтон Роус (1879-1970 гг.), первооткрыватель сарком у кур (саркома Роуса), ещё в 1911 г. добился с помощью бесклеточных фильтратов передачи опухолей курам нескольких поколений. Это позволило Ф. Роусу предположить, что причиной этих опухолей является вирус. Однако этот факт был не нов, так как несколькими годами раньше Г. Чиуффо, А. Серра, В. Эллерман и О. Банг добились передачи с помощью бесклеточных фильтратов папиллом и лейкоза птиц. В связи с тем, что в то время относительно причин развития рака господствовала клеточная теория Р. Вирхова, инфекционная теория происхождения опухолей отвергалась. Поэтому в течение двух десятилетий теория о вирусном канцерогенезе не вызывала никакого отклика. В период с 1912-13 гг. Ф. Роус выявил ещё две экспериментальные опухоли у птиц, вызванные бесклеточными фильтратами. В 1914 г. учёный высказал мнение, согласно которому все три открытые им экспериментальных опухоли принадлежат к новой группе заболеваний, вызывающих новообразования у кур. Наряду с этим Ф. Роус пытался выяснить условия, способствующие и препятствующие росту экспериментальных опухолей, а также найти черты сходства и различия между этими опухолями и «естественными» новообразованиями у млекопитающих. В начале 1930-х гг. Ф. Роус приступил к изучению злокачественного перерождения папиллом (доброкачественных опухолей) у кроликов и опухолей крыс и мышей. Было обнаружено, что рост и перерождение этих опухолей связаны с взаимодействиями между онкогенным агентом (в опытах использовался каменноугольный дёготь) и некоторыми факторами окружающей среды. В 1942 г. Ф. Роус предложил 3 гипотезы, касающиеся механизмов образования опухолей. Согласно первой из них, вирусы могут инфицировать организм ещё во время внутриутробного развития или в молодом возрасте, и в большинстве случаев не проявляться. Однако если на клетки, инфицированные вирусом, действует провоцирующий фактор, может начаться процесс перерождения клеток и рост опухоли. Согласно второй гипотезе, опухоли, которые на первый взгляд образуются самопроизвольно, могут вызываться химическими веществами – канцерогенами. Третья гипотеза заключалась в том, что «дремлющие» вирусы и химические канцерогены могут взаимодействовать, также вызывая опухоли. В 1956 г. Ф.П. Роусу была присуждена Нобелевская премия за открытие онкогенных вирусов. Эту премию он разделил с Чарльзом Хаггинсом, открывшим, что рост некоторых опухолей зависит от гормонов желез внутренней секреции, и предложившим метод гормонотерапии в онкологической практике.

В 1946 г. отечественный вирусолог Л. А. Зильбер выдвинул вирусно-генетическую гипотезу возникновения опухолей: опухолеродный вирус встраивает свой геном в геном клетки-хозяина, превращая её из нормальной в опухолевую, которая и служит затем источником роста опухоли. Вирус в дальнейшем больше не влияет на развитие последней. Поэтому весьма вероятно, что он находится во многих злокачественных опухолях животных и человека, не перевиваемых фильтратами, в скрытой, маскированной форме. В последующем гипотеза Л. А. Зильбера получила экспериментальное подтверждение в работах зарубежных учёных.

Выдающееся открытие при изучении онковирусов было сделано американскими вирусологами Ренато Дульбекко (род. 1914 г.), Ховардом Мартином Теминым (род. 1934 г.) и молекулярным биологом Дэвидом Балтимором (род. 1938 г.). Р. Дульбекко, с 1954 г. занимавшийся изучением вирусов опухолей, обнаружил, что опухолевые клетки трансформируются опухолевыми вирусами таким образом, что клетки начинают неограниченно делиться (клеточная трансформация). Выяснилось также, что когда делятся нормальные клетки и начинают вторгаться в пределы соседних тканей, то клеточная регуляторная система подаёт им сигнал прекратить деление. В случае опухолевых клеток система регуляции оказывается повреждённой. Х. М. Темин предположил, что клеточная трансформация вызывается вирусным геном, который стал частью клеточной ДНК. Согласно этой провирусной гипотезе, генетический код опухолевых РНК вирусов может быть переписан в клеточную ДНК ферментом, находящимся в белковой оболочке вируса, что позволяет гену проникшего вируса осуществлять контроль над генами клетки-хозяина.

В 1970 г. Х. М. Темин с С. Мизутани и Д. Балтимор независимо друг от друга изолировали фермент, который копирует вирусные РНК-гены в клеточную ДНК, и назвали его РНК-зависимая ДНК-полимераза. В настоящее время фермент известен как обратная транскриптаза, так как он транскрибирует (списывает) генетическую информацию от РНК к ДНК. Вирусы, обладающие активностью обратной транскриптазы и существующие как провирусы в ДНК клеток животных, были названы ретровирусами. За открытия, касающиеся взаимодействия между опухолевыми вирусами и генетическим материалом клетки, Р. Дульбекко, Х. М. Темин и Д. Балтимор в 1975 г. были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины. Это открытие явилось новой главой в исследовании онкогенеза. В последующем другие исследователи обнаружили, что многие нормальные клетки содержат копии вирусной РНК, близко связанной с РНК опухолевых вирусов.

Успехи в изучении физико-химических свойств вирусов, а также их морфологии (размер, плотность и др.) были в значительной мере обусловлены разработкой соответствующих методов очистки и концентрации. Предложенный впервые У. Стэнли метод очистки и концентрации вирусов растений с использованием химических реагентов был неприложим к вирусам человека и животных. При очистке и концентрации этих вирусов наибольшее распространение получил метод дифференциального (клеточного) центрифугирования. Первым, кто использовал для исследования вирусов животных и человека этот метод, был бельгийско-американский биолог, Нобелевский лауреат в области физиологии и медицины 1974 г. Альбер Клод. Проверяя гипотезу о вирусном канцерогенезе, А. Клод, для того, чтобы отделить онкогенный фактор от остальных компонентов клетки, разработал метод клеточного центрифугирования – разделения клеток на составные части центробежной силой при использовании мощной центрифуги. Этим способом А. Клод смог выделить онкогенный фактор из опухолевых клеток. Далее он вводил его экспериментальным животным и сравнивал частоту возникновения опухолей у этих животных и животных контрольной группы. Так было доказано, что выделенный фактор действительно вызывает рост опухоли. В последующем А. Клод установил, что онкогенный фактор является рибонуклеиновой кислотой. Это было первым бесспорным доказательством связи вирусов с развитием опухолей.

В 1940-х гг. вирус саркомы Роуса, с которым работал А. Клод, был выявлен путём электронной микроскопии. В 1972-73 гг. учёные, изучающие вирусный онкогенез, А. Д. Альтштейн, Р. Дульбекко, Р. Вайс, Г. Мартин и П. Фогт высказали гипотезу, согласно которой «раковые гены» у опухолеродных вирусов имеют клеточное происхождение и представляют собой ничто иное, как нормальные клеточные гены, регулирующие деление клетки. В процессе эволюции эти гены стали неотъемлемой частью генетического аппарата онковирусов. Последующие исследования полностью подтвердили существование раковых генов (современное название – онкогены). В 1989 г. за открытие клеточного происхождения ретровирусных онкогенов американский биолог Майкл Джеймс Бишоп (род. 1936 г.) был удостоен Нобелевской премии в области физиологии и медицины. В 1980-х гг. было показано, что онкогены несут код для производства белков, сходных по структуре с факторами роста и их рецепторами. К числу таких факторов относятся факторы роста нервной ткани, эпидермиса, фибробластов, впервые описанные Ритой Леви-Монтальчини (род.1909 г.) и Стэнли Коэном (род. 1922 г.). За открытие, имеющее фундаментальное значение для понимания механизмов регуляции роста клеток и органов, Р. Леви-Монтальчини и С. Коэн в 1986 г. были удостоены Нобелевской премии. Их открытие означало, что возникновение опухоли вызывается нарушением в регуляции факторов роста.

Успехи в профилактике и лечении вирусных заболеваний.Несмотря на то, что вирусология решает широкий круг задач, одной из главных её целей является профилактика и лечение вирусных болезней. В настоящее время в этом направлении достигнуты значительные успехи.

В 1966 г. Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) приняла программу ликвидации натуральной оспы на нашей планете. В создании этой программы принимали участие ведущие вирусологи мира — Д. А. Хендерсон, США; Ф. Феннер, Австрия, Д. Тагая, Япония; И. Д. Ладный, П. Н. Бургасов, С. С. Маренникова, СССР, и ряд других. В 1977 г. эта программа была успешно завершена. Ликвидация натуральной оспы в глобальном масштабе показала, какая значительная победа может быть одержана с помощью международного сотрудничества в тех случаях, когда цель точно определена, планы реалистичны, своевременно предоставлены для их выполнения все необходимые ресурсы. Этот опыт подтвердил возможность эффективного решения и других проблем здравоохранения. 8 мая 1980 г. 155 государств-членов ВОЗ на 33-й сессии единодушно одобрили выводы глобальной комиссии по удостоверению ликвидации натуральной оспы во всём мире.

Широкое использование вакцин для профилактики полиомиелита, кори, гриппа, эпидемического паротита, желтой лихорадки, вирусных энцефалитов, вирусного гепатита В, бешенства, краснухи значительно снизило заболеваемость этими инфекциями во всём мире. Актуальной проблемой современной науки является разработка вакцин для профилактики ВИЧ-инфекции, лихорадок Марбурга и Эбола, вирусных гепатитов А, Е, С.

В арсенале противовирусных средств в настоящее время имеются генно-инженерные интерфероны, индукторы продукции эндогенного интерферона, химиопрепараты антивирусного действия, специфические иммуноглобулины.

Итак, в течение экспериментально-вирологического этапа развития вирусологии, в результате всестороннего научного исследования накопились сведения, позволившие признать вирусы новой формой жизни, принципиально отличной от бактерий и простейших. Это осознание – результат коллективного труда учёных разных стран и разных специальностей: биохимиков, физиков, биологов, иммунологов, генетиков, молекулярных биологов, биофизиков, патологов, вирусологов, микробиологов. Только благодаря их объединённым усилиям установлено, что вирусы – это простейшие неклеточные формы жизни с облигатным внутриклеточным паразитизмом; состоящие из белковой оболочки, экранирующей снаружи геном, представленный молекулой только одного из типов нуклеиновых кислот (РНК или ДНК); не обладающие автономными метаболическими системами и размножающиеся путём многократного копирования своего генома с последующей его и белков оболочки сборкой за счёт пластических и энергетических ресурсов клетки-хозяина.

В течение экспериментально-вирологического периода вирусология сформировалась в одну из фундаментальных медико-биологических наук и, с увеличением количества предметов своего изучения, переросла в более обширную дисциплину – вирологию. Вирология – это наука о неклеточных, простейших формах жизни (вирусах, вироидах, прионах), изучающая их происхождение, морфологию, физиологию, репродукцию, эпидемиологию и разрабатывающая методы диагностики, профилактики и лечения болезней, ими вызываемых. Она подразделяется на общую и частную вирологию. Общая вирология изучает общие закономерности происхождения, строения и жизнедеятельности вирусов, вироидов и прионов на всех уровнях их организации (популяционном, организменном, клеточном, молекулярном и субмолекулярном), разрабатывает принципы диагностики, профилактики и лечения вирусных болезней. Частная вирология изучает отдельных представителей в зависимости от влияния их на живые организмы, в связи с чем следует различать фитовирологию (изучает вирусы, патогенные для растений и бактерий), зоовирологию (изучает вирусы, патогенные для животных) и медицинскую вирологию (изучает вирусы, патогенные для человека).

Вирология относится к наиболее бурно развивающимся наукам. Это обусловлено рядом объективных причин. Во-первых, в современной медицинской патологии удельный вес вирусных инфекций весьма велик и число новых вирусных болезней увеличивается. Их эпидемии наносят значительный ущерб экономике разных стран мира. Во-вторых, по-прежнему актуальным остаётся проблема вирусного онкогенеза. В-третьих, вирусные ДНК и РНК являются незаменимой моделью в решении проблем генетики, молекулярной биологии, генной инженерии.

Основными задачами медицинской вирологии следует считать: дальнейшее изучение роли вирусов, вироидов и прионов в патологии человека; создание эффективных профилактических и лечебных средств; разработку и совершенствование методов лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Знание основ вирологии необходимо врачам различных специальностей, поскольку вирусы, кроме острых инфекционных болезней, могут вызывать хронические заболевания терапевтического, неврологического, офтальмологического, гинекологического и других профилей.

Глава 2

Дополнительные материалы:

Сэнсэй 4.И͟͟с͟͟к͟͟о͟͟н͟͟н͟͟ы͟͟й͟͟ ͟͟Ш͟͟а͟͟м͟͟б͟͟а͟͟л͟ы͟ Анастасия Новых. История. Имхотеп.


Похожие статьи: