Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень

      Комментарии к записи Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень отключены

Завершающим этапом молекулярного клонирования является идентификация тех клеток-реципиентов, которые несут встроенный ген-мишень. Эффективность выбранного метода отбора определяет успех генно-инженерного проекта. Необходимо при этом учитывать, что не все клетки являются трансформированными и несут необходимый ген. Поэтому отбор обычно проводят в два этапа.

На первом этапе отбирают клетки, несущие соответствующий вектор, использованный для переноса генетической информации. Чаще всего клетки-реципиенты выделяют по тем маркерам, которые песет встроенный вектор. В случае применения в качестве вектора плазми-ды pBR322, которая несет два гена устойчивости к антибиотикам, отбор трансформированных клеток можно вести на агаризованной среде, содержащей ампициллин или тетрациклин, в которой эти клетки формируют колонии, и дальнейший отбор проводят уже среди

J. Л ЖХ. .Л. •

Помимо обнаружения клеток, трансформированных соответствующим вектором, существует необходимость отобрать среди них те, которые не только несут вектор, но и нужный ген — ген-мишень. Поэтому по завершении первого этапа идентификации приступают ко второму, на котором используют две группы методов, описанных ниже.

1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов. Определение гена-мишени проводят двумя способами:

а) прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК
(по методу Максама — Гилберта или по методу Сенгера);

б) гибридизационный анализ с соответствующей ДНК/РНК.

2. Методы, основанные на выявлении признака, кодируемого ге-ном-мишеныо:

а) иммунологическая детекция;

б) культивирование селективных питательных сред;

в) определение по продукту геиа-мишени.
Теперь немного подробнее.

Прямое определение иуклеотидной последовательности ДНК проводят, как уже было сказано выше, либо по методу Максама — Гилберта, либо по методу Сеигера. Их отличие заключается в следующем. В первом используется принцип химической модификации нук-леотидпых оснований ДНК с последующим выщеплеиием олигонук-леотида по модифицированному остатку. Полученный набор коротких олигоиуклеотидов с различными концевыми основаниями и различной длины разделяют электрофоретически и идентифицируют при помощи радиоавтографии. В методе, предложенном Сеигером, набор коротких иуклеотидов получают не химической модификацией, а при помощи ДНК-полимеразной реакции. При этом вместе с обычными пуклеотидами в синтезе используют терминирующие дидезоксирибо-иуклеотиды.

В случае использования специфических зондов для идеитифика-ции гена-мишени используют однонитевую ДНК или РНК, комплементарную данному гену. В эту ДНК (РНК) вводят радиоактивную метку по 5′-копцу (32Р). Затем проводят гибридизационный анализ с последующей идентификацией гибридных дуплексов.

Вторая рассматриваемая группа основана на идентификации признака, кодируемого геном, и включает следующие методы.

A. Непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок (про
дукт встроенного гена). При этом идентифицируется белковый про
дукт, для чего используются иммунологические методы или методы
определения его специфической активности.

Или идет отбор клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые встроенным геном. Так, например, отбирали дрожжи, синтезирующие гистидин, из популяций клеток, трансформированных смесью химерных плазмид.

Б. Использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень. Например, если встроен ген р-галактозидазы, то клетки можно отобрать на среде с лакто-

ЗОИ.

B. Иммунологическая детекция. Например, если в клетку встроен
ген человеческого белка — интерферона, то трансформированные
клетки можно отобрать при помощи антител к этому белку. Для
обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга на основе спе
цифического их взаимодействия с антителами часто используется
метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластико
вый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител
и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антиге-

ны из лизироваииых бактерий связываются с антителами па диске. Их положение определяют с помощью радиоавтографии.

Для выявления специфического клона в составе геномных или кДНК-библиотек, а также при количественном определении ДНК или РНК используются различные типы молекулярных зондов. Как правило, зонды (пробы) — это фрагменты ДНК или РНК, содержащие меченые 32Р-иуклеотиды. Работа с ними основана на их способности узнавать комплементарные последовательности в молекулах ДНК или РНК. Синтезированная на матрице специфической мРНК кДНК может быть использована в качестве зонда при скрииироваиии геномной библиотеки. Один из наиболее распространенных методов поиска специфических последовательностей основан на применении синтетических олигонуклеотидов, последовательность нуклеотидов в которых подбирается по аминокислотной последовательности небольшого участка искомого белка с учетом вырожденности кода. При условии точного совпадения последовательности, длины олигоиуклео-тидного зонда в 15 — 20 звеньев оказывается достаточно для достоверной гибридизации и обнаружения уникального гена. Такие зонды используются также для выявления после электрофореза специфических фрагментов ДНК или РНК и переноса их на нитроцеллюлоз-пый фильтр (методы «Саузерн-блоттипг» и «Нозерн-блоттинг» соответственно).

Нозерп- и вестерн-разновидности блоттинга используются для определения молекулярных размеров и количества специфических РНК и белковых молекул.

Для идентификации и выделения интересующих исследователя клонов разработан метод гибридизации в бактериальных колониях или фаговых бляшках. На колонии бактерий, выращенных на твердой среде, сначала накладывают нитроцеллюлозный фильтр. Бактерии прилипают к нему. После лизиса и денатурации под действием NaOH и фиксирования денатурированной ДНК прогреванием фильтр инкубируют в растворе с радиоактивно меченым зондом. По окончании гибридизации его отмывают от избытка зонда. Далее выявляют образовавшийся меченый гибридный комплекс путем контакта с рентгеновской пленкой. Сравнивая положение пятна на радиоавтографе с положением колоний на чашке, выбирают ту группу бактерий, которая дала положительный сигнал. Аналогичным образом поступают и при идентификации клонов на основе фаговых векторов. Результатом этих манипуляций является выделение искомых индивидуальных клонов (бактериальные колонии или фаговые бляшки).

Дополнительные материалы:

Metal Gear Solid: The Twin Snakes — The Movie (No HUD) (русские субтитры, english subs)


Похожие статьи: